6-培养基4.ppt

1、,培养基的配制及质量控制 2010年3月,一、培养基的配制,培养基是绝大多数微生物试验的基础。因此，培养基的质量是微生物试验成功与否的关键因素。适宜的培养基制备方法、贮藏条件和质量控制试验是提供优质培养基的保证。,培养基可按处方制备也可使用按处方生产的符合规定的商品化成品培养基，脱水培养基除附有处方和使用说明外还应注明有效期、贮存条件、适用性试验的质控菌株和用途。配制时应按使用说明上的要求操作，受潮结块不能使用，以确保培养基的质量符合要求。,使用容器,配制培养基使用的容器应是玻璃器皿或搪瓷器皿如搪瓷筒、量筒、漏斗、三角烧瓶、刻度吸管、试管、培养皿等。 禁用金属容器如铁、铜、铝容器，避免金属离子

2、与培养基成分结合，生成有害物质，影响细菌生长。,使用的器皿应 洗净，用蒸馏水或纯化水完全冲洗以消除清洁剂和外来物质的残留，并进行清除污物的确认后方可使用。 若于非洁净的玻璃器皿中制备，可能导致抑菌物质进入培养基中。抑菌物质可能是残留的玻璃器皿清洁用的清洁剂或之前玻璃器皿所盛装的物质。, 配制培养基最常用的溶剂是纯化水，特殊情况下需要用去离子水和蒸馏水，对热敏感的培养基应用灭菌水和无菌容器配制与分装，配制时若需加热助溶应注意温度不要过高。,对配制培养基的过程作详细的记录，记录内容包括：配制日期、培养基名称、成分、配制数量、质量监控结果等进行全面详细记录。,1、培养基的制备方法,称量 为保证培养基

3、质量的稳定可靠，在配制培养基时，在称量前要详细了解处方和使用说明，按照产品说明书的规定称量，各称量物的重量应记录。 各脱水培养基或组成培养基的组分应准确称量，并要求有一定的精确度。,配制 将准确称量的各组分或脱水培养基加入溶剂中，完全溶解，如需要可适当加热。所有的培养基对热都有或多或少的敏感，因此当培养基需要加热溶解时，应注意不要加热过度，否则会使培养基颜色变深。 配制培养基所用的器具应能方便控制加热和不断搅拌。当培养基需要添加其它组分时，添加后也应将其充分混匀。,分装 配制的培养基根据试验需要分装试管、倾注平皿、制备斜面（高层短斜面或低层高斜面）。 经灭菌的培养基分装，应在无菌环境下按无菌要

4、求操作，避免污染。,对热敏感的培养基如糖发酵培养基其分装容器一般应预先进行灭菌，以保证培养基的无菌性。,矫正pH 配制培养基必须矫正pH，干燥培养基也必须对pH进行验证，高压灭菌前的pH应比最终pH值高0.2左右。矫正pH后的培养基应加热、过滤，使培养基澄清。,2、培养基的灭菌,灭菌方法及条件不当可直接影响培养基质量，培养基灭菌方法和条件，应通過无菌性试验和促生长试验进行验证，验证方法同中國药典2010年版附录灭菌法。商品化的成品培养基或自配的培养基若采用不适当的加热和灭菌条件，有可能引起颜色变化、透明度降低、琼脂凝固力或PH的变化，而不符合培养基质量的要求。,培养基的灭菌应按照生产商提供或使

5、用者验证的参数进行。商品化的成品培养基必须附有所用灭菌方法的资料。,不同种类培养基应采用不同的灭菌方法，配制好的培养基灭菌一般多用流通蒸汽灭菌和滤膜过滤除菌。 流通蒸汽灭菌是最常用的最有效的灭菌法， 121，15min( 121，30min)或116，40min可杀死所有的细菌芽孢。,滤膜过滤除菌 如配制的培养基含有不耐热成分可采用滤膜过滤除菌和血清凝固器除菌。 滤膜过滤除菌采用孔径0.22um的滤膜过滤器，滤膜材质依过滤物品的性质及目的而定。不得对被滤过成分有吸附作用，不得有物质释放和纤维的脱落，也不得使用含有石棉的滤器。滤器和滤膜在使用前应进行验证，并进行灭菌。 血清凝固器80100、30

6、min，连续三天，间歇灭菌。,3、培养基的贮藏,商品化培养基应根据使用说明书上的要求进行储存。培养基标签上应标有批号，生产日期、有效期及培养基的有关特性。所采用的保藏和运输条件应使培养基最低限度失去水分并提供机械保护。,脱水培养基或单独配方组分应在适当的条件下贮存，如低温、干燥和避光，所有的容器应密闭，尤其是盛有脱水培养基的容器., 配制好的培养基应验证的条件下贮藏。保存在225避光的环境。 若保存于非密闭容器中，一般在三周内使用, 若保存于密闭容器中，一般在一年内使用., 琼脂培养基不得在0或0以下存放，防止冷冻破坏凝胶特性。 琼脂平板最好现配现用，如置冰箱保存，一般不超过一周，且应密闭包装

7、，若延长保存，保存期需经验证确定。 培养基灭菌后应立即取出，不得储藏在高压灭菌器中，避免影响培养基的质量。,固体培养基灭菌后的再融化应在加热的水浴中或采用流通蒸汽进行，只允许一次，融化的培养基应放在4550的水浴中，不得超过8小时。 使用过的培养基（包括失效的培养基）应按照国家污染废物处理相关规定进行。,二、培养基的质量控制,经实验室配制或由生产厂生产的培养基的质量高度依赖于其如何制备，采用不适宜方法制备的培养基将影响微生物的生长或复苏，从而影响试验结果的可靠性。,所有配制好的培养基均应进行验证，验证方法参照中国药典2010年版附录无菌检查或微生物限度检查项下有关规定进行。,实验室配制的培养基

8、监控项目 外观、性状、pH、促生长试验、定期的稳定性检查以及培养基有效期的确定。,验证时间 由同一批脱水培养基配制培养基时，若采用已验证的配制和灭菌程序，那么可不进行批批促生长试验。如果培养基制备的方法未经验证，那么，配制的每一批培养基必须进行促生长试验。 试验方法 根据培养基的用途参照中国药典2010年版附录无菌检查或微生物限度检查项下有关规定进行。,培养基的有效期 是指已通过促生长试验的培养基在整个有效期内均需符合这些相应的标准。每批培养基储存的时间将取决于一定存放条件（包括容器和密封性）的培养基组成成分的稳定性。,试验结果处理 当批培养基不符合促生长试验，应寻找造成不合格的原因。 这个调

9、查包括采取适当的行动以防止问题的重复出现。 如果未找到原因或还没有解决有关培养基的促生长问题，那么任何不符合要求的批次均不能使用。,一些用于进一步鉴定微生物的诊断试剂，如革兰染色、氧化酶试验试剂等。它们与培养基相似点是质量控制试验。在试剂用于未知样品鉴定前，选择正确的标准质控菌，按使用说明上的要求进行质控试验。,用于环境监控的培养基应特别小心防护。尤其是用于关键区域监控的培养基最好要双层包装和终端灭菌，如果不能采用终端灭菌的培养基，那么在使用前应进行100%的预培养。这样是为了防止将外来的污染带到环境中及避免出现假阳性结果。,1、测定PH值,每批培养基灭菌后均应测定PH值；在冷却至室温（25）

10、后，以无菌操作取出少量培养基进行测定。除非经验证表明培养基的PH允许的变化范围很宽，否则，培养基的PH的范围不得超过规定的0.2。,2、一般性状,制成平板或分装于试管的培养基应检查；容器和盖子的破裂，装量。 固体培养基因水分流失而造成表面产生裂缝或涟漪。 其他 如溶血，可能冷藏温度下形成的结晶，大量的汽泡，微生物污染，氧化还原指示剂的状况，批数量和有效期的检查和记录，培养基的无菌检查等。,液体培养基应观察培养基的颜色，是否有沉淀，微生物污染，氧化还原指示剂的状况，批数量和有效期的检查和记录等。,3、培养基的促生长和抑制性能试验,无菌检查用培养基 使用前应进行适用性试验，适用性试验包括无菌性检查

11、和灵敏度检查，无菌性试验是检查培养基灭菌是否完全，灵敏度检查是确定培养基的质量好坏、稳定与否，这对检验结果有极为重要的影响。培养基的灵敏度检查法如下：,灵敏度检查,菌种 金黄色葡萄球菌CMCC(B)26 003 铜绿假单胞菌 CMCC(B)10 104 枯草芽胞杆菌 CMCC(B)63 501 生孢梭菌 CMCC(B)64 941 白色念珠菌 CMCC(F)98 001 黑曲霉 CMCC(F)98 003,金黄色葡萄球菌 好氧性革兰阳性菌 和铜绿假单胞菌 好氧性革兰阴性菌 枯草芽胞杆菌 好氧性芽胞杆菌 生孢梭菌 厌氧菌 白色念珠菌 酵母菌 黑曲霉 真菌 这几类菌基本上代表了自然界常见的微生物,

12、也是药品中常见的污染菌； 。,灵敏度检查培养基接种量,试验菌 培养温度 培养基 培养时间 接种管数 装 量 () (天) （ 支） （ 支） 金黄色葡萄球菌 3035 硫乙醇酸盐流体 3 2 12 铜绿假单胞菌 3 2 12 生孢梭菌 3 2 12 白色念珠菌 2328 改良马丁 5 2 9 黑曲霉 3 9 每种菌液接种量含菌小于100cfu 同时做1支空白对照,结果判定 空白对照管应无菌生长。 若加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。 若加菌的培养基管不生长或生长不好，判该培养基的灵敏度检查不符合规定，不能用于无菌试验，并寻找造成不合格的原因。 培养基的适用性检查可在供试

13、品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。,微生物限度检查(计数培养基)培养基的适用性检查 微生物限度检查(计数培养基) 使用前应进行适用性试验，适用性试验包括促生长、抑制及指示能力检查。,菌种 大肠埃希菌 CMCC（B）26003 金黄色葡萄球菌 CMCC（B）26003 枯草芽孢杆菌 CMCC(B)63501 白色念珠球菌 CMCC（B）98001 黑曲霉 CMCC（F）98003,检查方法,菌种 培养基 加入菌数 培养温度 培养时间 （cfu） （） （h） 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 营养琼脂 50100 3035 48 枯草芽孢杆菌 黑曲霉 玫瑰红钠琼脂 50100 2328 72

14、 白色念珠球菌 白色念珠球菌 酵母浸出粉胨 50100 2328 72 葡萄糖琼脂,菌悬液制备后在室温下放置应在2小时内使用，若保存在28可以在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在 28，在验证过的贮存期内使用。,结果判定,被检培养基上的菌落平均数不得小于对照培养基菌落平均数的70%，且菌落形态、大小应与对照培养基上的菌落一致。判该培养基的适用性检查符合规定。,控制菌检查用培养基的适用性检查,控制菌检查用培养基的促生长、抑制及指示能力检查 控制菌检查 培养基 特性 试验菌株 大肠埃希菌 胆盐乳糖 促生长能力 大肠埃希菌 抑制能力 金黄色葡萄球菌 MUG 促生长能力+指示能力 大肠埃希菌 曙红

15、亚甲蓝 或麦康凯 促生长能力+指示能力 大肠埃希菌 大肠菌群 乳糖胆盐 促生长能力 大肠埃希菌 抑制能力 金黄色葡萄球菌 乳糖发酵 促生长能力+指示能力 大肠埃希菌 曙红亚甲蓝 或麦康凯 促生长能力+指示能力 大肠埃希菌,沙门菌 营养肉汤 促生长能力 乙型付伤寒沙门菌 四硫磺酸钠亮绿 促生长能力 乙型付伤寒沙门菌 抑制能力 金黄色葡萄球菌 胆盐硫乳琼脂或沙门、 志贺氏属琼脂培养基 促生长能力+指示能力 乙型付伤寒沙门菌 曙红亚甲蓝琼脂 或麦康凯琼脂 培养基 促生长能力+指示能力 乙型付伤寒沙门菌 三糖铁琼脂 培养基 指示能力 乙型付伤寒沙门菌 铜绿假单 胆盐乳糖 促生长能力 铜绿假单胞菌 胞菌

16、 抑制能力 金黄色葡萄球菌 溴化十六烷基三 促生长能力 铜绿假单胞菌 甲铵琼脂 抑制能力 大肠埃希菌 绿脓菌素测定 用培养基 促生长能力+指示能力 铜绿假单胞菌,金黄色葡 亚碲酸盐肉汤 促生长能力 金黄色葡萄球菌 萄球菌 抑制能力 大肠埃希菌 卵黄氯化钠琼脂促生长能力+指示能力 金黄色葡萄球菌 或甘露醇盐琼脂 抑制能力 大肠埃希菌 梭菌 梭菌增菌培养基 促生长能力 生孢梭菌 哥伦比亚琼脂 促生长能力 生孢梭菌 白色念 沙氏葡萄糖肉汤 促生长能力 白色念珠菌 珠菌 沙氏葡萄糖琼脂 促生长能力+指示能力 白色念珠菌 念珠菌显色培养基 促生长能力+指示能力 白色念珠菌 吐温80玉米琼脂 促生长能力+

17、指示能力 白色念珠菌,检查方法,1、液体培养基促生长能力检查 增菌培养基促生长能力检查 分别接种不大于100cfu的试验菌于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最 短培养时间下培养。与对照培养基管比较，被 检培养基管试验菌应生长良好。,2、固体培养基促生长能力检查,固体培养基促生长能力检查 取试验菌各0.1ml（含菌数50100cfu）分别涂布于被检培养基和对照培养基平板中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。被检培养基与对照培养基生长的菌落大小形态特征应一致。,3、培养基抑制能力检查,液体培养基抑制能力检查接种不少于100cfu的试验菌于被检培养基中，在

18、相应控制菌检查规定的培养温度及最长时间下培养，试验菌应不得生长。,4、固体培养基指示能力检查,培养基指示能力检查 取试验菌各0.1ml（含菌数不大于100cfu)分别涂布于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度及时间下培养。被检培养基中试验菌生长的菌落形态、大小、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。,结果判定,被检培养基的菌落数不得小于对照培养基菌落数的70%，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。判该培养基的适用性检查符合规定。,说 明,1、在实验室中，培养基若使用同一批脱水培养基，并采用已验证过的配制和灭菌方法配制那么由同一批脱水培养基配制的培养基可以不必批批进行灵敏度检查。如果培养基制备的方法不经验证，那么，必须对每一批配制的培养基进行灵敏度试验。,2、使用商品化培养基必须注意其有效期，有效期是指已通过促生长试验的培养基在整个有效期内均需符合这些相应的标准。每批培养基的存放时间将取决于存放条