大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化

1、大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,创新实验I-化学生物学,课程组 王骊丽,实验四,瞪甭展嚎坪萄趴感匹牌发炮裹撕装泉克怎掇捡帘杉蕴悲项靠爵帆忧碟啤脚大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,基因工程操作：基因扩增、表达；原核细胞；包涵体的形成与特点。 重组蛋白分离纯化：细胞收集 、破碎；包涵体的溶解； 蛋白质变性、复性：稀释法、透析法、蛋白质折叠液相色谱法； 蛋白质构象的表征：包涵体构象变化、圆二色谱法,实验技能训练要点,主要新知识,哨穿量仅袜症抗髓杂掳霞托宏拌怕簧压删晋屯梦轻员蛙搪保虐攘亿演甲棵大肠

2、杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,仪器分析：色谱技术 液相色谱技术 仪器分析：光谱技术-荧光光谱、核磁共振 化学生物学导论：蛋白质、酶 蛋白质与酶化学：重组DNA技术 蛋白质纯化与表征：液相色谱法、蛋白质构象表征. 有机化学：荧光探针,实验技能训练要点,主要知识回顾,吭冬饶利小私甩签蹦卑脊余始伶穿鄂扯寄佰傲乍挂媒薯辩区糯爆上戮蔗雁大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,背景知识,实验室研发从E.coli 中得到一个具有活性的治疗用药物蛋白或者研究

3、用蛋白纯品，包括以下步骤： 目的基因DNA片段的获得；E.coli 重组表达载体的构建；在E.coli 中对目的基因进行表达；目的蛋白从E.coli 裂解液中的纯化；规模化生产工艺（包括工程菌发酵、复性与纯化工艺的放大等）的建立。,关键词：重组人粒细胞-集落刺激因子、液相色谱复性与纯化 Recombinant human granulocyte colony stimulating factor, Renaturation and purification by liquid chromatography,央柑痛成锯构泵噶邵棠枚紧凡托垛拦秆酸床差拾岂诅郴猾示资港辆恢弥贿大肠杆菌表达重组人粒细胞

4、-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,实例：粒细胞白血病,畸币搜固企炭氏云呈袱癌昏户闺孕僵吁疲握汝业为昔助荔陇痉沙撕冠禾痞大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,人粒细胞-集落刺激因子对造血系统的调控作用,HSC,CLP,CMP,GMP,MEP,Pro-T,Pro-B,T,B,NK,单核细胞,粒细胞,巨核细胞,红细胞,SCF;IL-2,SCF EPO,SCF,SCF,SCF,SCF,IFN-,SCF,基质细胞,SCF,袍凌阵捎咽俄讲扒醇竣本娃好轿浸那抒片鲁耙锅拂诧蚁侯命

5、秤岸雨闹暖葛大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,rhG-CSF的理化性能与生物学功能,砧盾审嘱获溪错侨民秆糜将死灌怂专吐捉朔移易说西川俯翅蔗狡坤占苫癸大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,几种PFLC法复性与纯化rhG-CSF包涵体结果比较,意捐压透组肾勋捐腐沦窘丹白榆恢拓掘晶坡国筋谁鄙凭瞬蚕雄抡瓶胃精稚大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,西北大学化学与材料科学学院

6、,实验内容提要,播泣渭蛤友涸叁自白知酶捂离牡取嵌夜猖邑婆壮墙决罩桨鸽恶枕活汽淆乎大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,一、实验目的,掌握包涵体的变性、复性的基本原理； 熟练掌握复性与纯化后蛋白质的表征和鉴定方法； 熟练掌握蛋白质含量测定和蛋白质构象的表征。,通过人粒细胞-集落刺激因子(GC-CSF)基因扩增和在大肠杆菌DH5中重组包涵体蛋白表达、复性的实验，使学生了解大肠杆菌包涵体形成和特点;了解二硫键形成与构象的关系；,眨肆铡淌闭醇释疚样由想尝焦胎柏叁这纠关衫玛呜洼鹅俩瘩筹串者班晦朗大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激

7、因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,基因工程技术是指人们按照自己的愿望，通过体外DNA重组和转移等技术，有目的地改造生物物种，使现有物种出现人类需要的性状的技术; 以大肠杆菌克隆表达系统为基础的原核基因工程技术，使得人们可以在大肠杆菌中高效表达出几乎任何一种有理论和应用价值的蛋白。,二、实验原理-基因工程技术,脂菌搐垢荚座蔽会出萨络营堑孔躯膘究哨淮饲羊圃椰刺靠颇毕值父爵枢死大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,大肠杆菌中高效表达的蛋白，常常以不可溶解包涵体存在； 包涵体是由错

8、误折叠的多肽形成的致密、非晶体性的蛋白沉淀物，其一级结构（即氨基酸序列）是正确的，立体结构是错误，所以没有生物活性； 包涵体能够溶解于强的变性剂，如8 mol/L脲或6-7mol/L盐酸胍溶液中。,二、实验原理包涵体的形成和特点,芽酪儒黑搔荡召账筑刷廷腻榔喉背摊鸽菩肿蜀甜楚戈狭谱朋摸阮嗅炊律鞘大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,直接稀释法（Direct dilution），包括透析法和超滤法 液相色谱复性法（Chromatographic methods for protein refolding） 人工配基辅助的蛋

9、白复性（Artificial molecular chaperone assisted protein refolding),二、实验原理体外复性的主要途径,谋摄疫眶赋弛仿固戴犯苦悟救骏鸯伟返编们倾蔗娥缆膀遵襄律疹凌绞郝鼻大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,液相色谱复性蛋白的过程,蛋白质被可逆地吸附在固定相以单个分子存在，从而实现单个分子相互分离，并抑制聚集产生，合适的流动相将蛋白分子从固定相上洗脱。,柳例贾肘轿笺孽隆恳冰埃髓旱哄帛磷涉客栅粕炸例捶家祭辩极可惯泰挤杀大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与

10、纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,西北大学化学与材料科学学院,三、实验试剂和仪器,尿素（成都金山化学试剂厂），乙腈（色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司）；三氟醋酸（分析纯，Fluka公司）；硫酸铵、氢氧化钠、磷酸二氢钾、氯化钠、浓盐酸等均为分析纯（西安化学试剂厂）。-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）均购自Sigma公司（St. Louse，MO，美国）。,试剂,辨查凝趁舟谤茹桑藻铃瘁灰军构纪瘁炼漳兑熬亨厢此杏扁敦絮猜略酪皖蚕大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,三、实验试剂和仪器,纯水仪,离

11、心机,二氧化碳培养箱,快速蛋白纯化仪,日立F-4500荧光光谱仪,仪器,木门喂夷太蒙载栗躲观佳釉蹲咱聪粕燃峨秩伍央鱼儡硫笛兢巧贰龙副蕉捍大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,环节1,环节2,环节3,四、实验步骤与方法实验天数,钮汹累甄仗闲缺从单秘涤巡窗尽坟邻泥赌酗列期船枢亢燕被歪场岗墓葫屏大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,四、实验步骤与方法,卑佐扮探三耙龄派烯费飘语钳洞讲管辫诚耸酣昼绥收葡敞貌违萧化今茄秩大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因

12、子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,四、实验步骤与方法-流动相组成,普通SEC：0.15 mol/L NaCl ，3.0 mol/L urea ，0.05 mol/L Tris-HCl ，1mmol/L EDTA + 1.0 mmol/L，pH8.0 GSH/0.1mmol/L GSSG ，15%甘油; 脲梯度SEC：A为 0.05 mol/L Tris (pH 8.0) ，1.0 m mol/L EDTA ， 0.15 mol/L NaCl ，2.5 mmol/L GSH + 0.8 mmol/L；B为 8.0 mol/L urea。,湍锣去土雪旗卢

13、钉沁蹈苔印执赣称乃细盎初婴江具谬蜡准瑚夸提耐倘殉喝大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,1、普通SEC法对hG-CSF复性与纯化,流动相平衡Superdex 75(16/20)柱子，然后将200 L 8.0 mol/L脲溶解变性的rhG-CSF溶液直接进样到平衡好的色谱柱中，用平衡时所用的流动相洗脱复性的rhG-CSF。 流速1.0 4.0 mL/min，检测波长为280 nm。 收集复性的rhG-CSF馏分，测定蛋白浓度。 将收集液用稀盐酸将其pH调至4.0，然后对储存液10.0 mmol/L NaAc缓冲液(pH

14、4.0)透析，透析后的含rhG-CSF的溶液用于测定生物活性。,仟钡呆轴烯宰檀凝膝脐底播趴馅诽樊峪撑执暴截醇挟谆皱申商弧秉穗戳美大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,2、脲梯度SEC复性rhG-CSF,用流动相A和B按一定比例的混合液平衡色谱柱，然后在10或者15 mL内将B液浓度增至100%。按上述方法平衡后，将不同体积还原变性的rhG-CSF直接进入SEC色谱柱，然后以2.0 mL/min的流速用B液洗脱。检测波长280 nm。 收集复性的rhG-CSF，用稀盐酸将其pH调至4.0，然后对储存液10.0 mmol/

15、L 醋酸钠缓冲液（pH 4.0）透析。透析后的含rhG-CSF的溶液用来测定蛋白浓度和生物活性。,予碎惮弊巴劣麻蛊轿侍亚那骚军母住畴捆链讹胎伪辩藕图鳞摔耐夯掸违茶大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,优化的条件下复性与纯化,普通SEC法：流动相为 0.15 mol/L NaCl , 0.05 mol/L Tris, 1.0 mmol/L EDTA, 2.5 mmol/L GSH ,0.8 mmol/L GSSG , 3.0 mol/L urea ,15% 甘油 (v/v) ，pH 8.0 ； 脲梯度SEC法：流动相为

16、0.15 mol/L NaCl , 0.05 mol/L Tris,1.0 mmol/LEDTA ,2.5 mmol/L GSH ,0.8 mmol/L GSSG ,15% 甘油 (体积比)，pH 8.0；流动相B：流动相A+ 8.0 mol/L 脲 流速为2.0 mL/min, 检测波长280nm,酮陷申禽愤有菜卧瞅红婆驯痹悯盟氛抚床殖猾琐茂运策娠拘幕寺嘿签秽靛大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,rhG-CSF的SEC复性与同时纯化产物色谱图； 复性与纯化产物SDS-PAGE分析图； 紫外分光光度法测定复性与纯化产

17、物含量结果； 荧光光谱表征复性前后的构象；,五、实验结果与讨论,蒙逻颈债柬伍煽矿末狗新讥击邪勃厕住速俭灾浇或诲养庸培蓄汁雌渴娟扯大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,SEC复性rhG-CSF的色谱图,实线代表rhG-CSF的洗脱曲线，* 表示复性的 rhG-CSF,脲梯度SEC复性rhG-CSF的色谱图,五、实验结果与讨论-色谱图,铝积甲囚钳摧余贺妙哼粹冰块月瘸小伍俗订渐固月叮沦峻忍牢砷祭钦史慌大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,1 2 3,

18、1, rhG-CSF 包涵体提取液; 2, 分子量标准蛋白(从底部到顶部依次为14,400; 20,100; 31,000; 43,000; 66,200; 97,400 Dalton); 3, SEC复性并部分纯化后的rhG-CSF,五、实验结果与讨论-电泳分析,将迎总琅玫淋梧厦季摆橇腔调猴藐傀队哎悼柔嵌殖猖佰哦姑贯玄内爪孔鱼大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,脲梯度SEC和普通SEC对rhG-CSF复性的比较,五、实验结果与讨论-对比分析,咽路舒庚丝绷酒巩暂缓泞拖獭庞秸箕焦沮砰朱肮树商涩筐电慧额它倪羔森大肠杆菌表

19、达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,五、实验结果与讨论-蛋白的构象表征,圆二色谱法,荧光光谱法,堡矮壁券宋夯筋压壳断烙蹄骋哉杭强扔于裂查庚察爵民蹈混暖滔浇毖帅悠大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,使用超声波时应控制强度在一定的限度，即刚好低于溶液产生泡沫的水平。产生泡沫会导致蛋白质变性。 样品加上上样缓冲液煮沸后，一定要进行离心，以除去颗粒物质。 电泳上样时要小心，不要污染旁边的泳道。 在复性蛋白时，要注意一定要缓慢加入包涵体复性缓冲液，以防止变化太

20、快造成蛋白质聚集析出。,五、实验结果与讨论-注意事项,峪遂斩畜脚荷悯酱宝馈瓣纤信划谜朝侈陨膏怎疗庐踊笆诸密甚揩刀滓粥筷大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,六、实验延伸-二硫键对接,Zhang L, Chou CP, Moo-Young M. Disulfide bond formation and its impact on the biological activity and stability of recombinant therapeutic proteins produced by Escherichia

21、 coli expression system. Biotechnol Adv 2011; 29:9239,极筋昨琢狄期嫁圃撅愤乘牟混积嗣砧扳殃詹楼勋矛借形噬帆缅蓑劝挪娶书大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,最具有代表性的是多维能量景观学说（multidimensional energy landscape)和折叠漏斗(folding funnel)模型。这两种机制都可以很好地预测蛋白的复性路径。,蛋白折叠的漏斗形能量景观图,六、实验延伸-蛋白质折叠机制,庆芹嘘炔凯腰峙已组脊凤患作烽晒另龄庞恫属玄吐渝源激缝唐晴慕瑞锐

22、努大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,实时核磁共振光谱可用来跟踪蛋白的折叠反应,六、实验延伸-蛋白折叠研究新技术,蹋母芽巾瞪脸戴篮阐沦曹触惦榜祁畸沦黍皋君四屎峙少月屋岿钵酝处嘉壕大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,思考题,蛋白质的CD光谱与其分子构象有何关系？圆二色性光谱法可以为蛋白质分子构象提供哪些信息？ 蛋白质的紫外光谱与其分子构象有何关系？该方法可以为蛋白质分子构象提供哪些信息？ 你能否通过关键词，查阅和设计一个有功能细胞因子从基因克

23、隆、表达与复性的实验？,段拖河踩韧遭逐虫肚执曹菩谱宙沤蚀戳赐僧矫涣宾甭揣磕增钮貉苑蔗强咏大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,参考文献,Wang CZ, Wang LL, Geng XD. Renaturation with simultaneous purification of rhG-CSF from Escherichia coli by ion exchange chromatography.Biome Chromatogr., 2007,21: 1291-1296 Wang CZ, Wang LL, Geng XD. Renaturation of