伪狂犬病毒PCR诊断..ppt

1、实验9了解伪狂犬病毒PCR诊断、实验目的：1、PCR反应的原理、方法及操作步骤. 2 .掌握伪狂犬病毒PCR检查的方法，实验内容：1，阐述PCR反应的原理、方法及操作步骤，向同学们展示PCR反应的动画2 .伪狂犬病毒PCR检查。 什么是PCR？ 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，简称PCR )又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶扩增技术。 一、PCR反应的原理、方法和操作程序、PCR及相关技术的发展历史(1)，1983 Cetus公司的K. Mullis在这个年末(12月16日第一次成功实验)发明了PCR。 关于1985pcr的文章首次由Cetus

2、公司Saiki等人在Science上发表(R. Saiki，S. Scharf，F. Faloona，K. Mullis，G. Horn，h )。 1985年底成立的Perkin-Elmer Cetus器械公司(PECI )于今年11月发表了第一个PCR试剂产品和第一个热循环修订。 1989 Science报道了耐热性DNA聚合酶Taq酶的发现，预示着分子时代的到来。 12月，Science杂志将PCR及其使用的聚合酶命名为最初的“年度分子”。 PCR及相关技术的发展历史(3)，1992年3月Cetus公司获得Taq酶、热循环放大器等专利的Kary Mullis因PCR的发明获得了诺贝尔化学奖

3、。 PCR及相关技术的发展历史(4)，90年代中期PCR的临床应用开始在国内全面开展1998年实时荧光PCR技术开始在中国广泛应用，1999年西方发达国家尝试将PCR应用于血液检测，PCR原理，PCR选择性扩增DNA或RNA 其基本原理是基于体内细胞分裂中DNA半保留复制机制和体外DNA分子在不同温度下双链和单链相互转化的性质，人为调控体外合成系统的温度，使双链DNA成为单链。 与单链DNA人工合成的引物退火，以及在dNTP的存在下耐高温的DNA聚合酶将引物沿着单链模板延长为双链DNA。 进行高温变性、低温退火、适宜拉伸等反应循环，可以迅速扩展目标DNA。 PCR原理、PCR技术在模板DNA、

4、dNTP、Mg2、适当的Buffer等条件下，用耐热的Taq聚合酶代替DNA聚合酶，用合成的DNA引物代替RNA引物，进行DNA改性、引物与模板的结合(复原性DNA模板的热变性是将放大的DNA加热到940C左右，解开双链DNA形成单链，从反应体系中游离出来作为模板。 (2)将模板与底漆的结合(退火或复原性)系温度降低到适当的温度(520C左右)，使添加的底漆与模板DNA的两端(3末端)碱基序列互补结合。 (3)引物的拉伸使体系温度上升到720C左右，Taq聚合酶以碱互补的原则将dNTP连接到DNA引物3的末端，拉伸链，形成两条与模具互补的新链。 以上是一次PCR循环(改性、反复性和伸展) (新

5、合成的链可以作为下一个循环的模板)，在上述(改性、反复性和伸展) 3个步骤中反复循环，PCR产物指数增幅。 模板DNA的放大倍数T=2n (n:周期数)。PCR原理、sampledenaturatationprimerannealingprimerextension、PCR product、标准PCR反应体系、10放大缓冲液10ul 4种dNTP混合物各200umol/向l引物10100pmol结晶器DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶2.5u Mg2 1.5mmol/L中加入双或三蒸水至100ul，2. PCR各要素及其作用(1)结晶器PCR结晶器的线性DNA模板好，量适度， 一般以1

6、02105拷贝的RNA为模板时，需要RNA -cDNA-PCR，将其称为RT-PCR. (2)耐热DNA聚合酶(称为Taq DNA聚合酶。 在94改性52退火72的延迟循环30次的过程中，保证PCR不变失活。反转录、酶及其浓度，目前有两种Taq DNA聚合酶供应天然酶：从活热水杆菌中提纯基因工程酶：大肠杆菌合成典型PCR反应约2.5U (指总反应体积为100 ul时)浓度过高可引起非特异性扩增， 浓度过低则合成产物量减少，引物在PCR特异性反应的关键PCR产物的特异性依赖于引物和模板DNA的互补程度的理论上，如果知道任何一个模板DNA序列，可以按照其设定修订将互补的寡核苷酸链作为引物， PCR

7、可使模板DNA在体外大量扩增，引物设置修订原则(1)，引物长度： 15-30bp，常用20bp左右的引物有效长度不得超过38 bpmer，否则最佳拉伸温度为TaqDNA聚合酶的最佳温度(72 ) 无法保证PCR扩增产物的特异性引物扩增跨度：以500bp可扩增至10kb的片段引物碱： G C含量优选为40-60%，如果G C过少、G C过多，则非特异性带ATGC容易随机分布，5个以上的嘌呤和吡啶引物设置修正的原则(2)，二次结构二次互补，以免引物内部出现二次结构，特别是三末端的互补，引物二聚体形成，非特异的扩增带引物3末端的碱基要求严格配对，避免了末端碱基配对导致的PCR失败引物中能够添加适当酶

8、切点的目标序列优选具有适当的酶切点，这有利于酶切分析和分子克隆，引物设定修正的原则(3)， 引物特异性：引物与核酸序列数据库的其他序列没有明显的同源性，因此产生最低引物量所需要的结果良好3358 www-genome.wi.MIT.edu/CGI-bin/dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系的dNTP呈颗粒状，保存错误易改性失活dntp溶液呈酸性，使用时配合高浓度后，1M NaOH或1 m tris-1 多次冻融应使dNTP在PCR反应中分解，dNTP应为50200umol/L，特别注意4种dNTP的浓度相等(等摩尔调和)，其中任何一种浓度与其它几种不同(过高或过低)时，引起错配浓度

9、过低时，PCR产物的产量dNTP与Mg2结合，降低游离的Mg2浓度，Mg2浓度、Mg2对PCR扩增的特异性和产量产生显着影响，在一般的PCR反应中，当各种NTP浓度为200umol/L时，Mg2浓度为1.52.0 mmol/L 浓度过低时，Taq DNA聚合酶的活性降低，反应生成物减少，PCR反应条件的选择、PCR反应条件：的温度时间循环次数、温度和时间的设定：改性退火拉伸这3个温度点标准反应采用3温度点法， 双链DNA在9095变性，引物退火结合靶序列，然后迅速升温至7075，在Taq DNA聚合酶的作用下，将引物链沿模板拉伸，对短靶基因(长度为100300bp时)采用双温点法，退火和拉伸退

10、火延伸65左右，变性温度和时间：解链不完全是导致PCR失败的最主要原因，一般9394lmin模板DNA变性低于93需要时间，但温度不能过高。 这是因为高温环境会影响酶的活性。 该步骤如果不能使靶基因铸型或PCR产物完全改性，就会导致PCR失败，退火(恢复性)温度和时间：退火温度影响PCR特异性，比较重要的因素改性后温度迅速冷却到4060，可使引物与铸型结合。由于模板DNA比引物复杂得多，引物与模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞退火温度和时间，取决于引物的长度、碱组成及其浓度，目标基序列的长度对于20核苷酸、G C含量约50%的引物是理想的在=4(G C)2(A T )反复性温度

11、=Tm值-(510)TM值的允许范围内，选择高反复性温度可以大幅减少引物和模板间的非特异性键，提高PCR反应的特异性。 恢复时间通常为3060秒，足以在引物和模板之间完全耦合。 在拉伸温度和时间：拉伸温度： 7075之间选择常用的温度72过高的拉伸温度不利于底漆和模板的结合。 扩增反应时间：根据扩增片段的长度，1Kb以内的DNA片段、扩增时间1min (充分) 34kb的目标序列需要将34min扩增10Kb延长至15min，过长则导致非特异性扩增引起的低浓度模板的扩增，扩增时间稍长， 循环数根据循环次数决定PCR放大程度的循环次数主要依赖于铸模DNA的浓度循环次数： 3040次之间选择的循环次数越多，非特异性生成物的量也越多，(6)残奥表改性温度和时间一般选择： 940C，30秒退火温度和时间为依赖浓度和G C含量的一般选择： Tm - 5拉伸温度和时间一般选择： 70 75个循环次数依赖铸模浓度，一般循环： 30次，PCR反应特征，特异性强灵敏度高，简便、快速对标本纯度要求低，PCR产物分析凝胶电泳分析法是琼脂糖凝胶(Agrose ) 或者在