免疫组织化学常用技术方法大全.ppt

1、免疫组织化学常用方法大全,基本原理与操作步骤,第一节 免疫酶细胞化学,免疫酶细胞化学是免疫组织化学中最常用的方法，它是在抗原抗体特异反应存在的前提条件下，借助于酶细胞化学手段，检测某种物质（抗原抗体）在组织细胞内的存在部位。即预先将抗体与酶连结（酶标抗体），再使其与组织内特异性抗原反应，经细胞化学染色后，在光镜或电镜下观察分析。,一、常用酶的种类 用于标记的酶应具备以下几点： 酶催化的的底物必须是特异性的，且容易被显示，所形成的产物易于在光镜或电镜下观察。 所形成的终产物沉淀必须稳定，不向周围组织弥散。 较易获得酶分子，最好有商品出售。, 中性pH时，酶应稳定，酶标记抗体后，保存12年活性不应

2、改变。 酶标过程中，酶与抗体连结，不能影响二者的活性。 被检测组织中，不应存在与标记酶相同的内源性酶或类似物质。,免疫组织化学常用酶 名称 分子量 内源性 商品 HRP (POD) 40-50 kD + 有 ALP (AP) 80-120 kD + 有 , HRP/POD（辣根过氧化物酶） 显色原理： HRP + H2O2 HRP H2O2 + 供氢体 （电子供体） HRP + H2O + 供氢体 （氧化型）,DAB（二氢基联苯胺） 棕褐色 AEC（3-氢-9-乙基咔唑） 红色 TMB（四甲基联苯氨） 深蓝色, ALP/AP（碱性磷酸酶） 底物：萘酚（As-Mx） 发色团：Fast Blue

3、Fast Red BCIP/NBT,血细胞、淋巴细胞 内源性过氧化酶含量较高 可选用ALP/AP,二、染色步骤及原理 间接法： 1. 石蜡切片经二甲苯脱蜡，下行酒精至水; 2. 未固定的冰冻切片，丙酮固定 2030 min，风干1530min;,3. 用0.03%H2O2处理切片1530 min(室温)，封闭内源性过氧化酶的活性； 4. PBS洗涤2min; 5. 0.05% Tween-20/PBS，5min（室温）； (微波修复抗原、蛋白酶消化),6. 0.1%-1% BSA湿盒内孵育1525 min（室温），然后轻轻弃去孵育液（不冲洗） ；(或二抗动物的正常血清); 7. 轻轻弃去孵育液

4、，滴加PBS稀释的第一抗体，湿盒内孵育12 h （20-25）； 8. PBS充分冲洗， 5min 3次，以去除切片上非特异性吸附的抗体；,9. 滴加PBS稀释的HRP标记的第二抗体，湿盒内孵育4560 min （室温）； 10. PBS漂洗 5min 3 次； 11. 显色，0.01% - 0.1% H2O2 0.01% -0.05% DAB, 1015 min； 12. 细胞核复染（甲基绿或苏木素）； 13. 封片、观察、记录。,亲和组织化学（affinity histochemistry） 植物凝集素与糖类 生物素与抗生物素 葡萄球菌A蛋白与IgG 阳离子与阴离子 激素、维生素、糖类与受

5、体,第二节 抗生物素-生物素免疫细胞化学染色法,一、基本原理 抗生物素（卵白素） avidin 分子量68 000 糖蛋白 生 物 素 （维生素H） biotin 分子量 244,biotin,avidin,biotin,biotin,biotin,二、抗生物素-生物素-过氧化酶复合物技术 (Avidin-Biotin-peroxidase Complex technique, ABC法) 其特点是利用抗生物素分别连接生物素标记的第二抗体和生物素标记的酶。,second antibody-biotin + Avidin + biotin-HRP,ABC complex,操作步骤： 1. 石蜡切

6、片脱蜡，系列酒精至水； 2. 冰冻切片丙酮固定10min，PBS洗涤5min 3；,2. 第一抗体，室温孵育60 min ； 3. PBS洗涤 5 min 3次 4. 生物素标记的第二抗体，孵育45 min 5. PBS洗涤 5 min 3次,6. ABC复合物， 45 min 7. PBS洗涤 5 min 3次 显色（H2O2/DAB）、复染、封片 观察、记录,second antibody-biotin + Avidin + biotin-HRP,ABC复合物的配制： biotin：avidin 1：4 avidin 10g/ml biotin 2.5g/ml 临用前30分钟配制,ABC法

7、特点： 敏感性强，具有放大作用 特异性强，背景染色淡 方法简便，节约时间 由于生物素与抗生物素具有与多种示 踪物结合的能力，可用于双重或多重染色,注意事项 内源性生物素活性及其消除：肝、肾、白细胞、乳腺预先以0.01%抗生物素和0.01%生物素溶液分别作用20 min，以消除内源性生物素。 试剂的差异，应进行预实验。 ABC试剂盒保存以4为佳。,第三节 葡萄球菌蛋白A（SPA）,葡萄球菌蛋白A（ staphylococal protein, SPA）是一种从金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质。 早在1940年，Vevwey发现某些金黄色葡萄球菌中，含有一种物质，在双向扩散试验中能与正常人血清形成

8、沉淀，1959年将其命名为A抗原。,一、免疫学特性 SPA具有与人及多种动物（豚鼠、猪、小鼠、猴等）IgG结合的能力。SPA结合部位是Fc段而不是Fab段，这种结合不会影响抗体的活性。SPA具有的结合力是双价的，每个SPA分子可以同时结合两个IgG分子，也可一方面同IgG结合，一方面与标记物如荧光素、过氧化物酶、胶体金、铁蛋白等相结合。,SPA对IgG免疫球蛋白亚型的结合有选择性，如 SPA 与人 IgG 亚型IgG1 、IgG2 、IgG4 有结合力，与IgG3没有结合力。,二、SPA在免疫组化中的作用 可作为二抗或标记抗体。SPA的最大优点是不受种属特异性的限制，还具有染色时间短、灵敏性高

9、和背景染色淡等优点。,SPA-胶体金技术（PGA技术）可在电镜水平检查抗原抗体反应的定位，是一种较为理想的免疫电镜技术。,SPA-HRP用于间接法的操作步骤： 切片脱蜡 第一抗体，37，孵育30min或4，2448 h PBS 冲洗， 5min 3次 SPA-HRP（1:100 1:400）， 30 min DAB-H2O2显色 复染、封片、观察、记录,第四节 凝集素,凝集素（lectin）是指一种从各种植物、无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白质，因其能凝集红细胞（含血型物质），故名凝集素。,植物凝集素 刀豆蛋白A （ConA） 麦胚素 （WGA） 花生凝集素 （PNA） 大豆凝

10、集素 （SBA）,一、基本原理 生物膜中含有一定量的糖类，主要以糖蛋白和糖脂的形式存在。凝集素的最大特点在于它们能识别糖蛋白或糖脂，特别是细胞膜中复杂的碳水化合物结构，即细胞膜表面的碳水化合物决定簇。一种凝集素具有对某一种特异性糖基专一性结合的能力。因此，凝集素可以作为一种探针来研究细胞膜上特定的糖基。,麦芽素 N-乙酰糖胺 菜豆凝集素 N-乙酰乳糖胺 刀豆素 -D-吡喃糖基甘露糖,凝集素具有多价结合的能力，能与荧光素、生物素、酶、胶体金和铁蛋白等示踪物质结合。,二、操作程序 直接法：标记物直接标记在凝集素上，使之直接与切片中的相应糖蛋白或糖脂相结合。,1. 切片脱蜡至水； 2. 凝集素标记物

11、（100 g/ml），室温，30min； 3. 荧光素标记物，封片用荧光显微镜观察； 4. PBS洗涤，5min 3次； 5. 显色、封片、观察、记录。, 间接法：将凝集素直接与切片中的相应糖基结合，而将示踪物质标记在抗凝集素抗体上。,1. 切片脱蜡至水； 2. 凝集素稀释液（10 g/ml），室温，30min； 3. PBS洗涤，5min 3次； 4. 标记的抗凝集素抗体（1:100），孵育30min； 5. PBS洗涤，5min 3次； 6. 显色、封片、观察、记录。, 糖-凝集素-糖法：过量的凝集素与组织切片中特定的糖基相结合，再与有过氧化物酶标记的特异性糖基相结合，形成一个三明治样的糖

12、基-凝集素-糖基的结合物。,1. 切片脱蜡至水； 2. 凝集素稀释液（10 g/ml），室温，30min； 3. PBS洗涤，5min 3次； 4. HRP标记糖基（10 g/ml），孵育30min； 5. PBS洗涤，5min 3次； 6. 显色、封片、观察、记录。,三、应用 作为细胞分化和成熟的标记 淋巴细胞的分群 小鼠胸腺皮质内不成熟的T淋巴细胞呈PNA阳性反应，在小鼠小肠集合淋巴小结的生发中心也发现有20%左右的PNA阳性反应细胞，后者是否属于不成熟的 T 淋巴细胞，值得进一步研究。, 作为细胞特殊类型的标记 研究人视网膜，PNA标记视锥细胞而不标记视杆细胞。 乳腺上皮细胞呈PNA阳性

13、反应，肌上皮细胞呈PNA阴性反应。,刀豆素A和蓖麻素存在于肾脏各部，PNA和双花扁豆凝集素（DBA）主要分布于远曲小管和集合小管上皮细胞，荆豆凝集素（UEA）主要分布在血管内皮细胞，而麦芽素分布在肾小球。, 肿瘤中凝集素结合的改变 肿瘤细胞伴有细胞膜的改变，细胞膜上的糖基也会产生相应的变化，可用凝集素检测出来。 凝集素可作为肿瘤特异性诊断的标记，肿瘤恶性的标记和不同肿瘤的分化标记。,第五节 链霉菌抗生物素蛋白检测系统,链霉菌抗生物素蛋白是从链霉菌中分离出来的不含糖基链的蛋白质，分子量47kD，含4个亚基，每个亚基都能与一个生物素分子结合。,抗生物素蛋白等电点为10，而链霉菌抗生物素蛋白等电点为

14、6.5，接近中性，几乎不与组织中的内源性凝集素样物质发生非特异性结合。因此，可产生低背景、高放大的效果。,一、SP法 （ Streptavidin Peroxidase conjugated method ） 生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶结合。,操作步骤： 石蜡切片，脱蜡至水； 过氧化酶阻断溶液，以阻断内源性过氧化酶的活性； 第一抗体； 生物素标记的第二抗体； 链霉菌抗生物蛋白-过氧化物酶溶液； 显色、复染、封片、观察。,S-P试剂盒包括以下内容： A. 内源性过氧化酶阻断剂 B. 正常动物非免疫血清 C. 生物素标记的第二抗体 D. 链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶,

15、二、SABC法 链霉菌抗生物蛋白与一定浓度的生物素化酶混合后，就能形成链霉菌抗生物素-生物素-酶复合物(SABC)。,SABC试剂盒包括以下内容： 正常动物血清 生物素化二抗 SABC复合物,SABC具有以下特点： 高敏感性 低背景 简便快速 结果稳定,第六节 免疫金技术（胶体金）,1971年，Faulk和Taylor首先将兔抗沙门氏菌抗血清与胶体金颗粒结合，用直接免疫细胞化学技术检测沙门氏菌的表面抗原。 胶体金技术逐渐得到完善和成熟，应用胶体金为标记物的免疫金染色（IGS）与免疫金银染色（IGSS）方法在光镜和电镜下可以单标记和双标记或多种标记同时观察细胞和组织结构，可以定性、定位、定量研究

16、。,一、基本原理 胶体金即金的水溶液 分散体系：分散相 + 分散介质 离子分散体系：以小分子或离子状态分散 胶体分散体系：分散相颗粒1100nm 粗分散体系：,二、胶体金的一般性状 1. 胶体金的颜色 胶体金颗粒在520nm之间，吸收波长520nm，呈葡萄酒红色 2040nm之间，吸收波长530nm，呈深红色 60nm，吸收波长600nm，呈兰紫色,2. 胶体金的稳定性 溶液的稳定性介于小分子离子溶液和粗分散系之间，溶胶的胶颗粒作布朗运动，不易受重力影响而下沉。然而溶胶又是不稳定体系，它的胶粒溶剂化作用很弱，总表面积大，当胶粒相互碰撞时，有自动合并为较大、较重的颗粒的倾向。,三、在免疫细胞化学

17、中的应用 （一）免疫金染色 1. 免疫金法 1978年，Geoghegan等首次应用免疫金探针检测B淋巴细胞表面抗原，建立了光镜水平的免疫金法（immunogold staining, IGS）,间接法：（以人肝组织HBsAg的定位为例） 石蜡切片脱蜡至水； 鼠抗HBsAg单克隆抗体（一抗），4过夜 金标兔抗鼠抗体（二抗） ， 37，45min ( 可以金标SPA代替) 复染（苏木素）、封片、观察、记录,2. 蛋白A-胶体金（ PAG）放大法（以5-HT定位为例） 石蜡切片脱蜡至水； 兔抗5-HT抗体，4过夜，或 37 1 h PAG 37 1 h 抗A蛋白抗体， 45min，37 PAG，

18、37， 45min 复染、封片、观察、记录,PAG放大法的优点： 使用试剂单一； 可大大提高IGS的敏感性，从而使应用IGS方法定位抗原时使用高稀释度的抗体成为可能； 背景干净。,（二）免疫金银法 将IGS与银显影方法相结合创立了免疫金银法（ immunogold-silver staining, IGSS）,基本原理： 胶体金颗粒起着一种催化剂作用，用对苯二酚还原剂将银离子（Ag+）还原成银原子(Ago)，被还原的银原子围绕金颗粒形成一个“银壳”，“银壳”一旦形成本身亦具有催化作用，从而使更多银离子还原并促使“银壳”越长越大，最终抗原位置得到清楚放大。,以人肝细胞内HBsAg定位为例 石蜡切

19、片脱蜡至水； 马抗HBsAg抗体，4过夜或37，12h PAG，37，45min 银显影 复染（苏木素）、封片、观察、记录,四、优点 1. 制备简单； 2. 标记简单：抗体、SPA、酶可通过物理吸附作用与胶体金颗粒形成稳定的金标复合物； 3. 适用范围广：光镜、透射电镜、扫描电镜、X线能谱分析等。 4. 特异性强：免疫金探针的非特异性吸附作用小，特异性高。,5. 敏感性高：用于电镜，其检测抗原或抗体的效率远远超过酶反应物，大大改进了免疫组化在电镜水平上的分辩率。光镜金颗粒经过银显影后得到放大，敏感性比PAP法高200倍，比ABC法高6倍，是迄今为止最为敏感的免疫细胞化学方法，特别适用于检测微量

20、抗原及石蜡切片标本中的微弱抗原。,双标记及多重标记：胶体金制备成不同大小的颗粒，分别标记不同的抗原或抗体。,第七节 半抗原交联抗体法,近年来，为提高敏感性和减低非特异性染色，在常规免疫组化技术的基础上，发展了半抗原交联抗体法（hapten-coupled technique），可作免疫酶或免疫荧光染色。,基本原理：半抗原标记第一抗体 半抗原：阿散酸（对氨基苯砷酸）、对氨基苯酰甘氨酸、亚对氨苯酰甘氨酸、二硝基苯氨基丙睛亚胺酸脂（DNP），通过酰胺化反应把半抗原结合到抗体分子上。,操作程序： 间接法（二步法）： 石蜡切片脱蜡至水； 半抗原标记的特异性抗体（一抗）； 荧光素或酶标记的抗半抗原抗体 ；

21、 荧光显微镜观察，或加底物显色。,优点： 1. 敏感性高：由于本法是通过酰胺化反应标记半抗原，对抗体活性损失极小，抗体保留较高的活性，能结合大量半抗原，平均每个球蛋白分子可同时结合20个半抗原分子，每个半抗原又可与抗半抗原抗体相结合，特异性免疫反应明显放大，其敏感性明显高于常规的免疫酶和免疫荧光染色技术，特别有助于发现滴度低的同种抗血清和含抗原量较少的组织。,2. 可用于双重免疫染色：利用两种无交叉反应的半抗原（如阿散酸、对氨基苯酰甘氨酸）分别标记来自同一种动物的两种特异性第一抗体，即可在同一张切片内同时显示两种不同的抗原。 3. 特异性强，敏感性高，背景染色低。,第八节 多聚螯合物酶法,多聚

22、螯合物酶二步法，也称非生物素检测系统，与简单的二步法相比，具有敏感性和特异性高、稳定性好的优点。,一、EnVision System ( DAKO ) EnVision System是将二抗和酶通过一个多聚化合物（葡聚糖）骨架联接成一个多聚体（即 EnVision ），每一个分子的复合物中约含70个分子的POD和10个分子的第二抗体，复合物中的POD的绝对数量远高于其他复合物，直接放大信号 4050倍，把传统的二抗、三抗分别孵育合为一次孵育。同时，人体内不存在该多聚化合物，无特异性干扰，故背景染色浅。,EnVision System工作程序： 1. 脱蜡、水化组织切片； 2. 一抗孵育 1030min; 3. PBS漂洗; 4. EnVision TM孵育1030min; 5. PBS