实时定量PCR简介.ppt

1、实时质量PCR、NJSunshine李文2005.11.17、实时定量PCR的介绍，定量PCR是在PCR定性技术基础上发展的核酸定量技术。 实时荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中添加荧光基，利用荧光信号的积累对整个PCR过程进行实时监测，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 该技术不仅实现了DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、可实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时性和准确性等特点。 (1)荧光域值：将PCR反应的前15个循环的荧光信号定义为荧光背景信号，而一般的荧光域值定义为3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。 (2)Ct值：也被称为循环阈值，其中

2、，c表示周期，t表示阈值。 PCR循环中对应于荧光信号开始从背景进入指数增加阶段的拐点的循环数。 在实际操作中可知，在该时刻、即在各反应管内的荧光信号到达了设定的域值时，Ct值依赖于阈值。 数学证明，Ct值与模板DNA的初始拷贝数(dRn )成反比。 作用原理、实时荧光定量PCR常用的检测模式有5种： (1)TaqMan探针(2)SYBRGreen (3)LUX引物(4)Molecular beacon (5)荧光谐振能量传递(ffman ) 这个探针不能伸到PCR中。 当探针完全保持时，3末端猝灭基抑制5发光基的荧光发光。 在PCR退火期。 探针与引物中所含序列内的DNA模板特异性杂交。 长

3、期引物通过Taq酶延长DNA模板的伸长，到达探针后，Taq酶发挥53外切核酸酶活性，进一步引起置换。 切断探针后，发射极基离开消光基，发射荧光信号。 此时，荧光检测系统检测出光密度增加。 每次复制模板时，探针都被切断，伴随荧光信号的发射。 该技术可以准确地定量模板，因为理论上发射的荧光基团的数量和PCR产物的数量是一对一的关系，光密度也与发射的荧光基团的数量成比例。 由于扩展产物短效率高，因此扩展长度一般为50150bp。 应该满足(1)GC碱含量为40%-60%的条件。 (2)一元酸序列的连续重复，特别是避免g。 (3)为了5端不成为g，因为g具有抑制荧光的作用，所以尽量使c个数比g多。 (

4、4)为了保证结合的特异性，长度必须在15-25个碱基左右。 (5)探针的Tm值至少比引物的Tm值高约10。 另外，探针和底漆不能形成二聚体，位置和上游底漆尽量接近但不重叠。 (2)SYBRGreenI荧光染料的作用原理，SYBRGreenI是仅与双链DNA小槽结合的染料，与DNA双链结合时发出荧光。 从DNA双链放出后，荧光信号急剧减弱。 因此，在一个系统中，其信号强度表示双链DNA分子的数量。 其缺点是可与非特异性双链DNA (例如引物二聚体)结合，但其产生的干扰可通过熔化曲线分析来解决。 (3)LUX引物、LUX (light upon extention )引物是一种利用荧光标记引物实现

5、定量的新技术。 目的：用类分子信标的发夹结构修订引物，使引物同时发挥荧光探针的作用。 引物对中的一个引物3端用荧光报告基标记。 没有单链模板时，该引物自身配对形成发夹结构，使荧光猝灭。 模板存在时，引物与模板配对，发夹结构打开，发生荧光信号。 使用LUX引物，无需特别设置、修改探针，可以节省成本，为实验设置修改提供宽松的条件。Invitrogen提供了五种荧光标志： FAM、JOE、HEX、TET and Alexa Flour 546。 通过Lux引物、LUXTM技术的优点以及methode，修订适合客户实验的LUXTM Primer。 2 .购买已验证。 也就是说，称为LUXTM Prim

6、er的引物只适用于留守基因(40 )和人基因。 通过与Invittrogen Custom LUXTM Primer服务中心联系，专家可以为您的实验设置和修订新的底漆。 Invitrogen qPCR产品，(1) superscript RT能够得到更高的cDNA产量和更好的特性。 (2) Platinum Taq DNA Polymerse为PCR反应提供了更高的特异性和产量。 (3) Supermixes含有Platinum Taq DNA聚合酶和UDG和dNTPs、ROX参照染料。 (4) sybr绿色和LUX引物、qPCR套件、1 .一步骤(1)abi系统superscriptplat

7、inumone-step qrt-pcrkitw/优化为roxsuperscriptplatinumsybrgreenone-step qrt -其他系统superscriptplatinumone-step qrt-pcrkitsuperscriptplatinumsybrgreenone-pcrkitsuperscriptplatinumsybrgreenone (3) rnaultrasenseone-stepquantitativert-PCR system超低量rna触摸面板的灵敏度放大的QRT-PCR系统(4)适用于4)platinumqrt-pcrthermoscrer的2 .二阶段法(1) 针对abi系统superscriptplatinumtwo-step qrt-pcrkitw/roxsuperscriptplatinumsybrgreentwo-step qrt -进行优化(2) 适用于其他系统的superscriptplatinumone-step qrt-pcrkitsuperscriptplatinumsybrgreenone-step qrt-PCR套件(3) Superscript Platinum CellsDirect两阶段superscriptplatinu