第5章_植物细胞工程制药.ppt

1、第五章 植物细胞工程制药,第一节 基本概念,植物细胞工程：以植物细胞为单位应用细胞生物学分子生物学的理论和技术，在离体条件下培养、繁殖和精细操作，使细胞的某些生物学特性按人们的意愿改变，从而改良品种、加速繁殖或得到有用的物质的一门科学技术。,基本概念,1.植物细胞的全能性（Cell Totipotency）：指任何具有完整的细胞核的活植物细胞，都携带一套完整的基因组（染色体），并具有发育成为完整植株的潜在能力。 2.植物的分化(differentiation):胚胎分化和器官分化，受精卵胚种子植株 3.脱分化(dedifferentiation):一定条件下，原来已经分化,并且具有一定功能的体

2、细胞(或性细胞)，丧失了原有的结构和功能,又重新恢复了分裂功能,就叫做植物细胞的脱分化。 4.再分化(redifferentiation):已脱分化的细胞和组织再次分化发育成为完整植株。,4.植物组织和器官的培养（Plant tissue culture） ：在无菌条件下，将离体的植物器官（根尖、茎尖、叶、花、果实、种子等）、组织（花药、胚乳、皮层等）、细胞（体细胞、生殖细胞等）、胚胎（成熟或未成熟的胚）、原生质体等培养在人工配制的培养基上，给予人工控制的培养条件，诱发产生愈伤组织或丛生芽或长成新的完整的植株的一种实验技术。也叫“离体培养”（Culture in vitro）或“试管培养”（I

3、n test-tube culture）。 5.细胞培养：形成单细胞无性繁殖系。,6.植物无菌培养： （1）幼苗及植株的培养 （2）愈伤组织培养（外植体，细胞聚集体） （3）悬浮培养（单细胞或小细胞团的液体培养） （4）器官培养（organ culture） （5）胚胎培养（embryo culture）,7.分生组织培养(meristem culture)：生长锥培养,人工培养基上培养茎端分生组织细胞。如:茎尖0.1mm 8.外植体(explant)：植物组织培养中用来离体无菌培养的离体材料，可以是器官、组织、细胞和原生质体等。如：根、茎、叶、花、果实、胚珠、花药、花粉等。 9.愈伤组织(C

4、allus)：外植体产生的一团无序生长的薄壁细胞。,10.无性繁殖系(clone)：克隆，同一外植体获得很多无性繁殖后代。 11.突变体(mutant)：经诱变处理而变异成新细胞 12.继代培养(subculture)：连续多代培养 13.初级代谢产物：核酸、蛋白质、糖类 形态发生（morphologenesis）：指细胞再生植株的过程或个体发育中机体及其器官形态结构的形成过程。,脱分化 再分化 形态发生 外植体 愈伤组织 生长点 芽、根 小植株,次级代谢产物,1.有明显的分类学区域界限 2.其生物合成需要在一定条件下才能发生 3.缺乏明确的生理功能 4.是生命活动的多余成分 主要有：生物碱、

5、黄酮类、萜类、有机酸、木质素、皂苷类、多元酚类 次级代谢作用 是由特异蛋白质调控产生的内源化合物的合成、代谢及分解作用的综合过程。,第二节 植物细胞工程发展简史,19世纪Schleiden和Schwann提出细胞学说 20世纪30年代胚胎培养和器官培养 20世纪90年代植物细胞培养工程：Phyton公司红豆杉(Taxus chinensis)细胞培养生产紫杉醇。,1674年，荷兰布商列文虎克(Anton van Leeuwenhoek)自制了高倍显微镜(300倍左右),第三节 植物细胞的形态及生理特性,一、植物细胞的形态 二、植物细胞的结构特征：细胞壁、液泡、质体 三、植物细胞的主要生理活性物

6、质及其他化学组分 四、植物培养细胞的生理特性 P-181,植物细胞的结构水平,糖原、淀粉和纤维素的结构,三、植物细胞的主要生理活性物质及其他化学组分 1.生理活性物质 （1）酶类（enzyme）:淀粉酶，蛋白酶，脂肪酶 （2）维生素（vitamin）:辅酶 （3）植物激素(phytohormones):调节代谢，影响生理过程，量微、作用大。 （4）抗生素和植物杀菌素(antibiotic):蒜，葱，萝卜,2.其他成分（后含物） （1）生物碱（alkaoid）:罂粟科，茄科 （2）糖苷类(glycoside):洋地黄毒苷 （3）挥发油(volatile oil):薄荷油，丁香油 （4）有机酸(o

7、rganic acid):苹果酸，柠檬酸，水杨酸,四、植物培养细胞的生理特点,表53 植物细胞与动物细胞、微生物细胞的比较 表54 植物培养细胞不同生长阶段的持续时间及特征 183184,细菌和哺乳动物细胞的化学组成百分比 Molecular Composition of Cells,物质 细菌 哺乳动物 水 70 70 无机盐 1 1 混合的小分子 代谢物 3 3 蛋白质 15 18 磷脂 2 3 其它脂 2 多糖 2 2 RNA 6 1.1 DNA 1 0.25,第四节 植物细胞培养的基本技术,一、植物材料的准备 ：P-186 外植体，无菌材料，常用灭菌剂，灭菌时间和顺序 二、培养基及其组

8、成 ：P-187 相当于无菌土壤 三、培养方法： P-190,二、培养基及其组成 （1）无机盐：大于30mg/L浓度大量元素，小于30mg/L微量元素,辅助酶的合成。 （2）碳源：甘油，糖类，肌醇 （3）植物生长调节剂：极低浓度（1mol/L） 5种天然激素：生长素（吲哚乙酸，IAA）、分裂素（6呋喃甲基腺嘌呤，6FA）、赤霉素、脱落酸、乙烯 高浓度生长素、低浓度分裂素刺激细胞分裂；低浓度生长素、高浓度分裂素刺激细胞生长；过量的赤霉素和酚类化合物能掩盖上述现象。 （4）有机氮源：氨基酸 （5）维生素：B族VB1，VB6和泛酸，生物素，肌醇, 根据无机离子在细胞内的作用分为四大类 大分子的结构成

9、分主要是C、H、N、O、P、S 等； 各种酶反应所需的主要离子，包括Ca2+、Cu2+、Mg2+、K+、Na+、 Cl-等； 各种酶活性所需的基础微量元素，包括：Co2+、Cu2+、Fe3+ 、Mn2+ 、Zn2+等； 某些生物特殊需要的微量元素，如碘、铯、溴等。,植物组织培养的程序,第一步：预备阶段 （1）外植体的选择：优良种质、健壮、适宜发育时期、适宜部位和大小 （3）培养基（Culture medium）的配制 一个完善的培养基成分：无机营养成分：大量元素（浓度大于0.5毫摩尔/升）、微量元素（其浓度小于0.5毫摩尔/升）；有机营养成分；植物生长调节物质（激素） （2）外植体的表面消毒灭

10、菌 材料自来水冲洗蒸馏水75%酒精30 S 无菌水1-2次1-2%次氯酸钠或次氯酸钙饱和液消毒10-30min或0.1-0.2%升汞（加吐温）5-10 min 无菌水洗4-5次。,第二步 接种（接种室） 第三步 培养（Culture）（培养室） （1）诱导去分化阶段 即初代培养 ：诱导产生愈伤组织、原球茎、顶芽和腋芽、不定芽、体细胞胚状体等。 （2）继代增殖阶段培养： 即继代培养，将初代培养的产物切割、分离转接到新鲜的培养基上培养。以增加培养物的数量。 （3）生根培养阶段,第四步 试管苗驯化移栽 （1） 植物组织培养技术 （2） 植物脱毒与快繁技术 意义： 快速繁殖，保持优良品质 生产无毒苗，

11、提高苗木品质 节约土地、环保,花药及花粉培养技术 意义：单倍体育种 基本程序：外植体选择外植体(花蕾)预处理外植体消毒剥取花药（花粉粒）接种诱导培养分化培养 植物胚胎培养(embryo culture of plants)技术 意义：克服杂交育种中杂交不亲和或杂种胚的败育，获得种间或属间杂种；倍性育种。内容：子房培养，胚乳培养，胚珠培养 植物细胞培养(suspension culture)技术 意义：生产次生代谢物质,三、植物细胞大规模培养系统（方法） 1.成批培养法：将培养基一次性加入培养器中，接种、培养、收获细胞。 2.半连续培养法：在反应器中投料和接种培养一段时间后，将部分培养液和新鲜培

12、养液进行交换。 3.连续培养法：在反应器中投料和接种培养一段时间后，以一定速度连续采集细胞和培养液，并以同样速度供给新鲜培养基以使细胞生长环境长期维持恒定。生长速度取决于基质的浓度（Monod公式）。培养时间长，无菌技术要求高。细胞的生长速度是由限制营养物质的平衡水平决定的。如：烟草细胞,4.固定化培养法：植物次级代谢产物的累积主要在细胞生长的稳定期，细胞成块趋于分化时，细胞中各个细胞处于一定理化梯度下。 固定化反应器：网状多孔板；尼龙网套；中空纤维膜 优点：细胞位置固定，易于获得高密度细胞群及维持细胞间理化梯度，利于细胞组织化，易于控制培养条件及获得较高含量的次级代谢产物。 例如：辣椒细胞固

13、定于聚氨基甲酸乙酯泡沫中，维持23天，辣椒素产量较悬浮培养高1000倍。,第五节 影响植物次级代谢产物累积的因素,影响因素： 1.生物条件：外植体，季节，休眠，分化 2.物理条件：温度，光（光照时间，光强，光质），通气（O2），pH和渗透压 3.化学条件：无机盐（N,P,K），碳源，植物生长调节剂，维生素，氨基酸，核酸，抗生素，天然物质，前体 4.工业培养条件：培养罐类型，通气，搅拌和培养方法,一、外植体选择 不同外植体的悬浮细胞培养物，其最大次级代谢产物的累积时间各异。 例如（图52）：延迟期，加速期，与生长曲线平行累积，稳定期累积 P-193,二、培养条件的影响 1.培养环境的内在因素 营

14、养成分、生物及非生物元素、通气及混合程度、pH、与接种有关的因素 （1）接种和诱导：次级代谢产物的产率与外植体大小，细胞密度及营养成分密切相关，如紫草细胞培养营养成分1400mg/L时细胞干重2.8g/L，营养成分1900mg/L时细胞干重4.9g/L。 （2）基本培养基组成：磷，氮（NO3,NH4，有机氮源），铜,（3）碳源：光自养培养中CO2，异养培养中糖类 糖的作用：延长稳定期，蔗糖分解产物（葡萄糖）所产生的对内源性生长素合成的抑制作用，增强戊糖磷酸化途径有关酶的活性。 （4）植物生长调节剂：关键作用 （5）O2和pH：悬浮细胞培养搅拌120160r/min，固定化细胞培养通5CO2空气

15、。 pH56最有利 （6）渗出物：细胞悬浮培养后期，培养液中常含有各种代谢产物。,2.两步培养法（two-step culture） 生长培养基(growth medium)：实现细胞的高生产率 生产培养基(production medium)：较低含量硝酸盐，磷酸盐，糖,表512 不同培养基中紫草细胞生长和紫草素含量,a 附加10-5mol/L IAA，b 附加10-6mol/L IAA和10-5mol/L KT IAA（吲哚乙酸，IAA生长素） KT （6呋喃甲基腺嘌呤，6FA分裂素，激动素）,3.培养环境的外部因素 （1）温度：2028 （2）搅拌频率：大于28r/min （3）培养容器

16、的影响：实验室50500mL （4）光的影响：光（光照时间，光强，光质，强度），影响植物培养细胞的次级代谢产物，如：黄酮，黄酮醇，挥发油。 单冠毛菊 花色素苷合成由438nm和372nm光激发，萘醌的合成受日光灯的蓝光抑制。,第六节 植物细胞培养的生物反应器,植物细胞生物反应器的设计与细胞培养方式、各类细胞的不同生理特征及代谢方式有关。 装置类型：细胞大规模生产装置称为发酵罐（fermenter），生产次级代谢产物的装置称为生物反应器（bioreactor）。 1.摇瓶：简单振荡。 2.搅拌型生物反应器：根据搅拌部件外形与结构分很多类，高耗能，高损伤细胞。 3.环流生物反应器和鼓泡塔生物反应器

17、：依靠循环泵或压缩空气混合，根据气体导入形式分很多类。如：射流式、强制循环鼓泡塔式、转鼓式、膜或平床式。放大装置首先要考虑剪切力。,一、植物细胞大规模培养生物反应器的类型 1.机械搅拌式生物反应器 2.鼓泡塔生物反应器 3.气升式生物反应器 4.转鼓式生物反应器 固定化细胞生物反应器 6.各种生物反应器的性能比较,1.机械搅拌式培养系统根据植物细胞的特性，机械搅拌式生物反应器通常是在微生物发酵罐的基础上改进设计的。 搅拌装置要减少剪切力，一般改叶轮式为螺旋式；因为植物细胞生长周期长，需要随时补充水分和营养，因此必须设计加液装置； 由于植物细胞的生理活动需要新鲜空气，且细胞代谢也可能产生有害气体

18、，所以必须设计通气装置； 为便于取样观察，一般还设计有取样口。 优点：易于控制温度、 pH、溶氧及营养物质浓度，混合均匀。,2.鼓泡塔生物反应器 反应器底部的喷嘴及多孔板实现气体混合分散。 优点：适于对剪切敏感的细胞的培养，无运动部件，不易染菌，相对高的热量和质量传递，放大相对容易。 缺点：流体流动形式难以确定，混合不匀，缺乏非牛顿流体的流动与传递特性的数据。,3.气升式培养系统 考虑到机械搅拌式反应器的剪切作用难以避免，同时搅拌器转动的轴封处容易泄漏造成污染。因此，发展出空气提升式生物反应器，它是最适合培养植物细胞的反应器之一。 优点：低剪切力，较好的混合，较高的氧传递效果。无运动部件，不易

19、染菌，操作费用低。 改善营养供应：增加培养细胞与培养液的接触面； 避免细胞代谢产生的有害物质在局部积累而对细胞自身产生毒害； 缺点:高密度培养时混合不均匀。,气升式生物反应器,4.转鼓式生物反应器 通过转动促进反应器内氧及营养物的混合。 优点：在高密度培养时有高的传氧能力。 缺点：放大困难，大规模操作困难。,5.固定化细胞生物反应器 定义：指固定在载体（惰性基质）上，在一定的空间范围内进行生命活动的细胞。采用固相培养，细胞有一定程度的分化发育，从而刺激调控代谢物合成的基因表达，促进次级代谢产物的产生。 方法：吸附法（共价交联，表面固定化，膜固定化）；包埋法（多孔载体，凝胶包埋）； 材料：聚氨基

20、甲酸乙酯泡沫，中空纤维素 固定化植物细胞培养系统： 平床培养系统 立体培养系统,植物细胞固定化培养 优点： 1.可保护细胞免受剪切。 2.细胞可长时间重复使用，更换培养基带走代谢物。 3.易于实现细胞的高密度培养。 4.细胞间接触良好，易于分化，有利于次级代谢产物的合成。 5.减少细胞的遗传不稳定性。 6.易于实现连续化操作。 缺点：固定化培养的植物细胞其代谢产物必须分泌到细胞外， 多数植物细胞次级代谢产物存在于细胞内或分泌到液泡中。,植物细胞大规模培养程序： 选材： 培养器官、组织的选择：取有药效成分的部位，且该部位较易成愈伤组织。 细胞株系建立：建立悬浮细胞繁殖体系（液体培养）。 大量培养

21、：将选出的优良细胞株扩大繁殖后，可作为细胞工厂化培养的生产“种子”，进行大量培养。 产品提取与纯化：从植物细胞培养物中提取和纯化有用的产品。 应用：大规模培养植物细胞；生产有用物质。,应用： 得到大量植物细胞产物，如人参细胞粉；紫草细胞（紫草宁，消炎药物），紫杉醇（倍增时间1020d）。 液体培养得到次生代谢产物， (主要应用，但产量低)。 生物转化：利用酶的作用将底物转化为所需的产物。,举例：有用物质的生产 生物碱 苦参的愈伤组织苦参碱降血压、扩张血管，治冠心病。 乌头愈伤组织乌头碱驱寒、散风、通经、止痛 长春花愈伤组织长春花碱治白血病高效药 喜树叶愈伤组织喜树碱抗肿瘤 黄连愈伤组织小蘖碱

22、（黄连素的主要成分）抗菌消炎 萜类物质：利用人参愈伤组织培养生产皂苷已进入工厂化生产。紫杉醇 醌类物质：利用紫草、决明等愈伤组织培养，生产具有抗细菌活性的醌类物质。 蛋白质： 胰岛素多数从动物的胰脏提取，但价格昂贵。从苦瓜离体培养物中可提取胰岛素、SOD、木瓜蛋白酶、木瓜凝乳酶。 类黄酮类 ：银杏黄酮、花青素、查尔酮 甾体类：VD、激素、强心苷,存在问题 生长速度较慢，通常完成一次生产周期需45 周才能完成；而微生物的工业发酵只需几天就可完成发酵全过程。 植物细胞培养生产次生代谢物的总量一般比自然生长植物本身低。 生产技术上还存在一些问题。如：易受细菌、真菌的污染；次生代谢物的产量不甚稳定，成

23、本较高等。,各种植物生物反应器的性能比较,植物生物反应器选择标准 1.供氧能力及气泡分散程度 2.剪切力大小及对细胞的影响 3.高密度培养时培养液的混合程度 4. 温度、pH及营养物质的控制能力 5.细胞团大小的控制能力 6.易于放大 悬浮培养细胞干重20g/L以改进的机械搅拌式生物反应器为好。,第七节 植物细胞制药的进展与展望,一、诱导子在植物细胞工程研究中的应用 二、前体饲喂 三、两相法培养 四、转基因技术在次级代谢产物生产中的应用 五、植物生物转化技术与生物制药,一、诱导子在植物细胞工程研究中的应用 诱导子定义: elicitor 是植物抗病生理过程中诱发植物产生植物抗毒素和引起植物过敏

24、反应（hypersensitive reaction,HR）也称抗性反应或自身防御反应(self-defense reaction)的因子，包括侵染植物的微生物及植物细胞内的分子。（也称后感染防御物质，植保素cryptogeion）。 诱导子在植物与微生物的相互作用中，能快速、高度专一性地诱导特定基因的表达。 利用诱导子进行有目的的次生代谢产物调控及生物合成，成为大幅度提高培养物中代谢产物含量的重要方法之一。,1.诱导子（elicitor）的分类： 诱导子能够诱导植物细胞中一种或几种反应，并形成特征性自身防御反应地分子。 生物诱导子：植物在防御过程中为对抗微生物感染而产生的物质，包括：分生孢子、降解细胞壁的酶类、有机体的细胞壁碎片、有机体产生的代谢物以及培养物滤液中的成分。 非生物诱导子：不是植物细胞中天然成分但又能触发形成植物抗毒素信号的因子，如 庚糖苷、光、外部培养条件。,细胞内源性诱导子：来自植物细胞的分子，多为植物细胞壁在微生物作用下的降解产物（多糖：纤维素，果胶。糖