食品微生物学第六章.ppt

1、第六章 食品中的微生物及其产物的鉴定 微生物检测技术： 定量： 微生物数量的测定 定性：根据各种性状特征，对微生物 的种类鉴别。,传统食品微生物检测：以分离、纯化、培养为 基础 现代食品微生物检测： 新理论、新技术 遗传学特性、细胞组分、数值分类 快速、灵敏、特异,第一节 食品中微生物数量的检测方法,检测食品中微生物总数的方法： 1）活细胞的标准平板计数法 （Standard plate count, SPC） 2）最近似数测定法 （most probable number,MPN）,检测食品中微生物总数的方法： 3）染色还原技术估算具有还原能力的 各种细胞的总数 4）显微镜直接计数法（DMC

2、）,一、 传统的SPC方法,活细胞的标准平板计数法 （Standard plate count, SPC） 菌落总数计数法 “活菌”标准方法 意义： 判定食品被微生物污染的程度及卫生质量，也可观察微生物在食品中生长繁殖的动态。,菌落总数： 在一定条件下（需氧、温度、时间、pH)每克（每毫升）食品检验所生长出来的CFU（菌落形成单位）。,国标规定： 在需氧条件下： 细菌 NA 37 48h 霉菌 酵母 PDA 2528 5天,测定方法,检测样品的处理 稀释 倾注（涂布）琼脂平板 计数 报告,（一）样品采集,1、采样原则： 代表性 防止污染 2、采样的种类： 大样 一整批样品 中样 200g 小样

3、 分析的样品（检样）25g,3、采样方法： 无菌操作 采样用具必须无菌 尽量采集有包装的食品 粉末状样品 边取样边混合 液体样品 边振摇边混合 冷冻食品 保持冷冻状态 非冷冻食品 保存在05 ,4、采样数量和部位： 200g/件 乳制品 一瓶（个、罐、听） 粮 三层五点（表、中、下） 油 重点采取表层及底层油 5、采样标签： 名称 来源 数量 编号 时间. （二）送检 从采样到实验室越快越好 不得超过3h,（三）样品的处理和稀释,1）取样 无菌操作 25g放入225mL灭菌生理盐水的无菌瓶内（ 1：10稀释液） 2）均匀混合 均质器,3）稀释 4）倾注,1 ml,1 ml,1 ml,1ml,9

4、ml,9ml,9ml,9ml,1ml,1 ml,1 ml,1ml,1ml,1ml,5）倾注平板,稀释液移入平皿后，将46 的 营养琼脂培养基注入平皿约15mL, 转动平皿。 空白对照,6）倒置 培养 琼脂凝固后，翻转平板 细菌 37 48h 霉菌 2 8 5天,（四）菌落计数法,肉眼观察 放大镜 TTC（氯化三苯基四氮唑) 显色 （五）菌落计数的报告 报告单位： cfu/g(mL) 1、平板菌落数的选择： 30300 2、稀释度的选择：,（五）菌落计数的报告,3、菌落数的报告： 100以内时 按实数报告 大于100时 两位有效数字 16400 16000,涂布平板法,先倒平板 待凝固后，吸取0

5、.1ml 稀释液于平板表面上，用灭菌涂布 棒在整个平板上均匀涂布，培养 观 察。,涂布法的优缺点,可检测到热敏性菌体 菌落形态比较明显 更适合于严格的好氧菌 没有倾注法简便，易出现菌落重叠、混杂现象,二、旋转接种法（Spiral plate method）,1970年 FDA 原理： 接种针将样品液以螺旋方式从 平板中央往外连续接种。 接种量：0.05mL,优点： 可测定50500000cfu/mL的菌数 样品不需事先稀释 不需做2个重复 接种速度快 结果可人工计数，也可用激光计数器计数 人力与物力花费成本低廉 测定结果与传统方法相关性高,缺点： 设备投资较高 含颗粒样品容易堵塞管道 如果样品

6、的带菌量超出范围则结果准确性降低 对琼脂平板表面要求高,菌落计数的其它方法,膜过滤 MPN 染色还原计数法 DMC,三、膜过滤,SPC方法的改良 过滤膜的孔径 0.45um 收集菌体 提高检出率 直接显微计数 膜过滤与荧光染色方法结合,直接荧光膜技术计数法（ DEFT ） Direct Epifluorescent Filter Technique,DEFT微菌落计数,仅用于活细胞的检测 原理： 食品匀液经DEFT膜过滤，膜放在培养基表面，恒温培养至微菌落长出，显微镜观察 G- 3h G+ 6h,快速检测技术 特殊滤膜（0.5um）过滤样品液 滤膜经 啶橙染色 紫外光显微镜观察 活细胞 橙色荧

7、光 死细胞 绿色荧光 2030min,四、最近似数测定法（MPN）,选择3个稀释梯度的稀释液，每种稀释液接种3管（5管）装有培养基的试管中培养，根据实验结果查MPN检索表，得到样品中微生物数量。,1915年 McCrady发明 MPN的优点： 方法相对简单 与SPC相比，相似率较高 用选择性培养基可检测特殊的微生物类群 测定大肠菌群数量的方法,MPN的缺点： 需要大量的玻璃器皿（特别是5试管实验） 不能观察微生物菌落的形态 准确性不高,1、大肠菌群（coliform group）,领域用语 与粪便污染有关的细菌 定义： 一群需氧及兼性厌氧，在37 经24h能分解乳糖产酸、产气的革兰氏阴性无芽胞

8、杆菌。,主要包括： 大肠埃希氏菌属 （Escherichia） 柠檬酸杆菌属 （Citrobacter） 克雷氏菌属 （Klebsiella） 产气肠杆菌属 （Enterobacter）,目前，大肠菌群已被我国和许多国家用作食品质量评价的指示菌。一般认为，大肠菌群都是直接或间接来自人与温血动物的粪便。,2、检测大肠菌群的意义,粪便污染食品的指示菌 大肠菌群数的高低，表明粪便污染的程度和对人体健康危害性的大小 肠道致病菌污染食品的指示菌 大肠菌群数的高低，表明肠道致病菌存在的可能性大小（并非一定平行！）,3、大肠菌群检测方法与检验结果,检验结果：用每100mL（g）样品中 大肠菌群最近似数来表示

9、， 简称大肠菌群MPN.,检测方法：乳糖发酵试验、分离培养、 证实试验 见GB4789.3-1994,五、染色还原计数法,一种估计活性微生物数量的方法。 原理： 活细胞内含有还原酶，可把特定的 染料从一种颜色还原为另外一种颜色。,亚甲基蓝（兰色） 白色 刃天青（暗兰色） 粉红色或 白色 染色还原的时间与样品中微生物浓度 成反比,两种染料：,应用： 乳品工业上原料乳中的微生物检测 优点： 简便、快捷和经济 缺点： 不同的微生物还原能力不同，给估算带来了一定的困难。 不适用于含有还原酶的食品,应用及优、缺点,六、显微直接计数法（Direct microscope count, DMC）,一定量的食

10、品（0.001mL） 显微镜载玻片（1cm2） 烘干、固定、脱脂、染色 复式显微镜计数 换算,DMC方法的优点,快捷 、简便 能对细胞形态进行分析 载玻片易保存，作参考 可使用荧光技术增强效果,DMC方法的缺点,仅适于检含大量菌体的样品 准确性差 易造成操作人员的疲劳,七、棉拭子涂抹法,表层微生物的检测 应用于食品、 公共场所,方法： 1）无菌棉拭子蘸取灭菌生理盐水（10mL试管）均匀涂抹样品表面一定面积（5cmX5cm，1cmX1cm）后，放回试管中，及时送检；,2）试管振荡，使微生物悬浮于稀释液中； 3）按SPC方法进行梯度稀释、培养、计数。 此外，纸片法,第二节 物理、化学、分子和免疫方

11、法,一、物理方法,阻抗测定法 微量量热法,（一）阻抗测定法（impedance）,1899年 G.N,Stewart 估算 20世纪70年代应用 阻抗：交流电路中导电物质对电流所起的阻碍和抵抗作用，可由电导和电容计算。,原理： 微生物可使培养基中电惰性底物，如碳水化合物、蛋白质等营养物质代谢成为电活性产物（乳酸盐或氨等）当微生物生长繁殖时，培养基中的电惰性分子即为许多电活性分子所取代，从而使培养基的电导性增大，培养基的阻抗降低。,检测时间（detection time) 样品接种后从开始培养到阻抗值发生急剧变化的时间。 与原始菌数成反比 Bactomer细菌计数器 准确率 93% 10100个

12、 5h,（二）微量量热法 （Microcalorimetry）,细菌生长时产生热量 测定微小温度变化的仪器量热计 批次型：早期应用 流动型： 灵敏、快速,二、化学方法,（一）热稳定性核酸酶（DNAse ） S. aureus G（+） 凝固酶（+） 产肠毒素菌株 95%产热稳定性核酸酶 耐高温,原理： 检测食品中热稳定性核酸酶的含量，可以精确计算出金黄色葡萄球菌的数量。,分光光度法 热稳定性核酸酶是S.aureus生长的标志 凝固酵素是产肠毒素菌株的标志,（二）ATP的测定,生命体的主要能源 细胞中ATP含量恒定 ATP测定计数法的原理 根据ATP可与从荧火虫中提取的荧光素酶作用发光，发光的总

13、光量与ATP的量成正比。,光强度推算出细菌细胞数 液体发光分光计 照度计 结果与SPC法一致 1025min,ATP检测法的应用：,检测微生物数量的快速方法 医学： 尿样的检验 环境卫生：表面微生物的测定,（三）辐射测量法（Radiometric）,原理 利用细菌在代谢碳水化合物时产生CO2的原理，把微量元素标记到葡萄糖或其他糖类分子中。 放射能计数器,放射物的种类 C-14葡萄糖 C-14甲酸盐 C14-谷氨酸盐 放射量与菌数成正比 检测C-14所需的时间与食品中微生物的含量成反比。,应用 医学： “吹口气，查胃病” 30min 食品： 微生物含量高 56h 微生物含量低 更厂,三、食品微生

14、物的指纹识别和鉴定,“指纹”概念 由于每种微生物的化学组分（DNA、蛋白质）结构、性能有差别及其特异性代谢产物等通过分析技术出现的特征性的图谱,（一）血清学方法,特殊的抗体鉴定同源抗原 G- 菌体（O）抗原 鞭毛（H）抗原 热稳定性好 热稳定性差,抗原（Antigen，Ag）,Antigens are macromolecules that elicit an immune response in the body. Antigens can be proteins polysaccharides conjugates of lipids with proteins (lipoproteins

15、) and polysaccharides ( glycolipids ).,Antibodies are immune system-related proteins called immunoglobulins（Ig）. Each antibody consists of four polypeptides two heavy chains and two light chains joined to form a Y shaped molecule.,抗体（Antibody，Ab）,（二）噬菌体（phage）类型,原理： 根据噬菌体和它的宿主细菌之间的特殊关系，用已知的噬菌体鉴定其特定的

16、宿主细菌。,（三）分子生物学方法,基因探针技术 DNA扩增法 限制性片段长度多态性技术 脉冲场凝胶电泳,1.基因探针技术,探针（Probe）：经过标记的一段 短核苷酸，用于检测与之同源的核 苷酸序列。,Probe is a short labelled nucleotide used to detect homologous nucleotide sequence .,Length of probe： 20-1000bp Type of probe： Oligonucleotide probes （20-40 bp） Single stranded DNA probes （200-500 bp

17、 ） Double stranded DNA probes RNA probes or Riboprobes,Radioactive ：32P、35S、 3H、14C,Digoxigenin （Dig） Biotin Fluorescent dye,Choice of Labelling：,Non-radioactive ：,可检测的细胞数量： 106 -107 必须进行细胞富集 ！,探针检测的灵敏度与检测时间,细胞数量为 108，检测需要10-12h,2.DNA扩增法,（1）多聚酶链反应 Polymerase Chain Reaction，PCR 1985年，美国PE-Cetus 公司人类遗

18、传 学研究室的Kary Mullis 发明 1993年，Mullis 获得诺贝尔 化学奖,三步曲： 变性（Denaturation） 退火（Annealling） 延伸（Extension）,一个循环 （cycle）,一般进行25-30个循环,PCR反应的三步曲与五要素,Step 1：双链DNA热变 性（94）； Step 2：引物与模板单链DNA退火（55）； Step 3：DNA的聚合延 伸反应（72）； Step 4：扩增的双链DNA再次热变性（返回 Step 1）。,五要素：, 模板DNA（template） 引物（Primer） DNA聚合酶（Polymerase） 缓冲液（Buff

19、er，Mg+） 脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）,循环次数与产物的量,实际：Nf = N0 （1 + Y）N 其中Y为扩增效率,理论：Nf = N0 X 2 N 其中N为循环次数，N0为起始拷贝数， Nf为最终拷贝数,PCR,3,5,Heat,Heat,Heat,5,（2）随机扩增的多态性DNA,Random Amplified Polymorphic DNA （RAPD） Developed by Williams et al. (1990) using 10 base primers to generate random fragments from template DNAs RAPD

20、fragments can be separated and used as genetic markers or a kind of DNA fingerprint,Two related techniques: 1. Arbitrary Primed PCR (AP-PCR) Welsh and McClelland (1990) longer primers(18-25 bases),2. DNA Amplification Fingerprinting (DAF) Caetano-Anolles et al. (1991) very short primers (8 bases),Co

21、mponents of PCR and RAPD,RAPD 1. Buffer (Mg+) usually high Mg+ concentration 2. Template DNA 1 short primer (10 bases) anneals to any specific part of the template DNA 4. dNTPs 5. Taq,PCR 1. Buffer (Mg+) 2. Template DNA 2 Primers that flank the fragment of DNA to be amplified dNTPs 5. Taq,Two modifi

22、cations made to typical thermal cycling when RAPD is being done: Annealing temperatures are generally very low, around 36 C - This allows very short primers to anneal to template DNA More thermal cycles are used, typically 45 - This compensates for the inefficiency which results from using such shor

23、t primers.,Primer binds to many locations on the template DNA Only when primer binding sites are close and oriented in opposite direction so the primers point toward each other will amplification take place,RAPD,Template DNA,Primers point away from each other, so amplification wont happen,RAPD,Templ

24、ate DNA,Primers point in the same direction, so amplification wont happen,RAPD,Template DNA,Primers too far apart, so amplification wont happen, 2,000 bases,RAPD,Template DNA,Primers are just the right distance apart, so fragment is amplified,100 - 1,500 bases,RAPD,3.限制性片段长度多态性技术（RFLP） Restriction F

25、ragment Length Polymorphism,（1）限制性内切酶 (Restriction endonuclease）,保护细菌不受外来DNA侵入,来自细菌的一种内切酶,限制性内切酶的特点：,识别4-8 bp特定序列 (site specific),两股DNA上各产生一个切口,回文序列 (palindrome sequence),5- GTTACATGA GATC ACGGATTC -3 3- CAATGTACT CTAG TGCCTAAG -5,产生粘性末端 (cohesive end, sticky end),5- GTTACATGAG 3- CAATGTACTCTTAA,Eco

26、R I,5- TTACATGC 3- AATGTACG GC,Msp I,5- GTTACATGAG 3- CAATGTACTCTTAA,AATT CACGGATTC 3 GTGCCTAAG -5,5- TTACATGC 3- AATGTACG GC,CG GACGGAT -3 CTGCCTA -5,5-ACGGATTCGTT 3-TGCCTAAGCAA,Hpa I,5- AACTGTCGG 3- TTGACAGCC,Hae III,产生平末端(blunt end),5-ACGGATTCGTT 3-TGCCTAAGCAA,AACGTTACATGA 3 TTGCAATGTACT 5,5- AAC

27、TGTCGG 3- TTGACAGCC,CCAGGCTG -3 GGTCCGAC -5,（3）限制性片段长度多态性 (RFLP）,四、免疫学方法,精确性 (Accurate) 灵敏性 (Sensitive) 特异性 (Specific),（一）荧光抗体法（FA）,（Fluorescence antibody） 1942年创立，在食品和医学微生物中应用广泛。 原理：抗体与荧光物质结合而带有荧光，与相应抗原结合后，在荧光显微镜下可以观察，也可计数。,荧光素： 异硫氰酸荧光素（FITC） 若丹名B（Rhodamine B）,（二）沙门氏菌1-2实验（1-2 Test）,原理： 血清学原理 , 即抗原

28、抗体结合形成 肉眼可见的免疫带。,一种检测有动力的沙门氏菌的方法,在一个特殊的含两个容器的塑料设备中进行： 一个容器中装有选择性液体培养基，另一个中装有非选择性运动性培养基（半固体），并含有鞭毛抗体。 恒温培养时，运动性沙门氏菌经选择性培养后进入非选择性培养基，并与其中的抗体结合形成免疫带。,优点：将血清学反应和生化增菌过程结 合起来，特异性强； 不需特殊实验室条件，简便 ； 8-14小时内得出结果，快速 。 缺点：不能检测非运动型沙门氏菌， 免疫条带的判断有主观因素。,（三）酶联免疫吸附剂测定,Enzyme Linked Immunosorbent Assay,1971年Engvall和Pe

29、rlmann,（ ELISA）,can measure antibodies or antigens inexpensive, rapid, quantitative, specific sensitive (pg/ml) expensive equipment not required can be automated,ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及 抗原或抗体的酶标记。 结合在固相载体 表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性， 酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活 性，又保留酶的活性。,原理：,待测样品与固相载体表面的抗原或抗体起反应，加入酶标记的抗原或抗体也结合在固相载体上。此时固相上的酶量与样品中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成有色产物，产物的量与样品中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。,ELISA可用于测定抗原或抗体。测定中有三