细胞培养基本技术课件.ppt

1、细胞培养基本技术,基础知识,细胞培养的基本概念 在体外模拟体内生理环境等特定条件下,将组织或细胞进行孵育培养,使之生存并维持其结构和功能的方法.,基础知识,细胞培养 使用单个细胞悬液,组织培养 使用组织块（O.51m3）,器官培养 使用器官原基或器官的一部分,培养分类,原代培养: 取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。 传代培养： 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。 体内培养: 将实体瘤细胞直接接种于小鼠腹腔、腹壁或其他部位，引起腹水，腹水中含有瘤细胞，将这种腹水反复传代。,基础知识,基础知识,贴附生长 必须贴附于支持物表面才能生长，见于各

2、种实体瘤细胞,培养细胞 生长方式,悬浮生长 于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞,培养细胞生长的条件,1 细胞的营养需要：氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子、生长因子 2 细胞的生存环境 温度: 37 O2 CO2: 5% pH: 7.2-7.4 渗透压 3 无污染 4 无毒,实验准备,细胞培养室： 无菌操作区、清洗准备区、消毒无菌区、物品储藏区、培养孵育区、研究观察区 培养室仪器： 超净工作台、CO2培养箱、倒置显微镜、酶标仪、微孔板 震荡器、液氮罐、水浴锅、离心机、电动吸引器等 培养用耗材： 培养瓶、吸管、培养板、冻存管、记数板等,CO2培养箱设定的条件

3、为37 ，5CO2 。 使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题： 用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。 保持培养箱内空气干净。定期消毒 箱内灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。,CO2培养箱,实验准备,实验准备,培养用器皿的清洗、包装、消毒 无菌操作 培养细胞的观察、检测 培养细胞的传代 培养细胞的冻存与复苏,基本技术,本次实验课安排,Thank You !,清洗： 浸泡、刷洗、 浸酸（酸液配方：重络酸钾、浓硫酸） 冲洗（流水10遍、蒸馏水3遍） 包装：牛皮纸（密闭封口） 消毒：紫外线、消毒剂、干热消毒、湿热消毒、滤过消毒,清洗包装消毒,环境的无菌处理

4、操作手法 培养用品的无菌处理,无菌操作技术,目的: 原代细胞培养成功后,或传代细胞生长到一定的数量时,需要进行分离培养,否则细胞会因生存空间不足或密度过大,影响细胞生长. 细胞由原培养瓶分离稀释后传到新的培养瓶中的过程称之为传代培养.,细胞传代方法,细胞传代方法,根据细胞生长的特点，传代方法有3种：,基础知识,贴附生长细胞 的生长过程,停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后， 细胞虽有活力但不再分裂。,对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长， 活力最佳，最适合进行实验研究。,潜伏期：细胞有生长活动，而无细胞分裂。 细胞株潜伏期一般为624小时。,游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态， 细胞质回缩，胞

5、体呈圆球形。,贴壁期：细胞附着于底物上， 细胞株平均在10分钟-4小时贴壁。,基础知识,贴壁生长细胞传代方法：,1. 吸光培养瓶中的培养液 2.加入1-2 ml 0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准）静置2-10 min（显微镜下动态监测）。 3. 吸去胰蛋白酶液，加入培养液。 4. 用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。 5. 吸取1/101/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内。 6. 加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。 7. 将后者放入培养箱中培养。,培养细胞的观测,常规观察: 1 细胞形态: 轮廓是否清晰？ 胞质中是否出现空泡、脂滴或其它颗粒物？ 细

6、胞间隙是否加大？ 细胞形态是否不规则？或失去原有特征？ 2 细胞生长：是否老化？ 3 培养液：是否浑浊？是否变色？ 4 微生物污染：培养液浑浊变色？细胞脱落？菌丝？,特殊观察: 一 细胞记数： 取待测细胞悬液0.1ml加D-Hanks液0.9ml混匀后，滴入细胞记数板内，于低倍下记数4角的4个大方格内的活细胞数： 细胞浓度= 4个大方格内的活细胞数/4104稀释倍数（10）=细胞数/ml,二 细胞活力测定： 是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段之一。任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态上区别死、活细胞是困难的。 1.台盼蓝法 活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占细胞中的百分

7、比表示细胞活力 已淘汰,2. 四唑盐（MTT）比色法商品名为噻唑蓝 四唑盐比色法的原理： 活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值 MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒牲试验、肿瘤放射敏感性实验等。,1,2,3,4,单细胞悬液接种于96孔培养板，培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）,加入2mgml的 MTT液（50ul孔） 继续培养3小时,吸出培养液后，加入DMSO液 （150ul孔），振荡

8、10分钟， 使结晶物溶解。,酶标仪检测各孔 OD值，记录结果,操作步骤,细胞冻存和复苏,细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。,冻存和复苏的原则：慢冻快融,低温保护剂,当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。,细胞冻存和复苏,低温保护剂的应用,常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可

9、迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。,细胞冻存和复苏,细胞冻存和复苏,二,三,取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液, 用吸管吹打制成细胞悬液,加入1ml细胞悬液于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。,细胞冻存方法,一,慢冻程序,标准程序： 当温度在-25 以上时， 12 /min 当温度达-25 以下时， 510 /min 当温度达-100时，可迅速放入液氮中（细胞冻存器） 简易程序： 将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮

10、罐罐口，按每分钟温度下降12 的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投入液氮中。,细胞冻存和复苏,细胞冻存和复苏,细胞复苏方法,5分钟内用培养液稀释至 原体积的10倍以上。,从液氮中取出冷冻管，迅速投入3738 水浴中，使其融化（1分钟左右）。,低速离心10分钟,去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。,消化传代的关键步骤: 胰酶消化的程度 消化过度则对细胞的活性损伤较大，并有部分细胞漂浮，随弃去的胰酶流失；消化不足则细胞难于从瓶壁上吹下，反复吹打同样也会损伤细胞活性。,弃去培养液，在此可先摇动细胞瓶，使老化死亡贴壁情况不好的细胞随培养液弃去,致密单层细胞在细胞瓶上呈雾状，使瓶壁呈

11、半透明,刚加入胰酶，细胞仍呈致密单层,细胞开始皱缩但不明显，仍维持细胞正常形态：,细胞明显皱缩变小，细胞间隙增大不再致密，部分细胞维持正常形态，部分细胞皱缩变圆：,细胞基本皱缩变圆，此时细胞可吹打下,细胞完全皱缩变圆，此时应弃去胰酶，加入培养基后轻摇可将细胞从细胞瓶壁上洗下，将细胞悬液用吸管吹散后传代。,小技巧: 有经验后，可肉眼对光观察贴壁半透明的细胞层，判断消化程度。 如消化过头，会见到许多细胞脱落随弃去的胰酶溶液流失。也可以在倒数第二、三步时弃去胰酶，用瓶中残留的胰酶继续作用至最后一步的消化程度，这样略有点过也影响不大,目的: 对组织器官的生长、变化进行体外观察 强调组织器官的相对完整性

12、，重点观察细胞在正常的联系和排列情况下，相互之间的影响，和局部环境的生物调节作用,第一部分 细胞培养实验准备流程 第一天 配酸液. 重铬酸钾600g,浓H2SO4 4500ml,H2O 3000ml.配制过程中,当加H2SO4至2500ml时,出现大量的重铬酸钾结晶析出.后继续加H2SO4至10000ml,结晶溶解.溶液呈棕红色(强酸液). 第二天 浸泡盐水瓶，培养瓶等试验器材于洗液中，过夜。 第三天 从洗液中捞出试验器材。流水冲洗10遍以上。后用蒸馏水冲洗3遍以上。至50鼓风干燥箱中干燥。 第四天 用纸把盐水瓶，培养瓶等扎口。把吸管.试管.瓶塞等置于饭盒中。在灭菌器中高压灭菌，后烤干保存，置

13、细胞培养室内超净台中备用。,细胞培养瓶 5个 培养液瓶 4个 滴管 若干(饭盒) 离心管 若干(饭盒) 瓶塞、胶塞、棉花等 若干,第二部分 配制细胞培养用溶液 器材：烧杯.磁力搅拌器.分析天平.500ml量筒.吸管.30ml注射器.0.22um过滤器.贮液瓶.瓶塞.培养瓶 试剂： RPMI1640 (RPMI MEDIUM 1640) kcl （分析纯，分子量74.55 ） Nacl （分析纯，分子量 58.44 ） NaHCO3 （分析纯，分子量 84.01 ） Na2HPO4.12H2O （分析纯，分子量 358.14 ） KH2PO4 （分析纯，分子量 136.09 ） 酚红 （分析纯，

14、分子量 354.38 ） Hepes(分子量238.31),1mmol/l(200mlH2O溶解47.6g,用1mol/lNaOH调节pH至7.5-8.0，后过滤除菌，分装小瓶，室温或40c保存。 胎牛血清（无支原体，未经灭活，杭州四季清生物工程材料有限公司） 青霉素：80万u/瓶 链霉素：100万u/瓶 三蒸水,步骤： 一 配培养基 1 配制培养基的各种器皿都应做到绝对干净，烤干后使用 2 称取培养基粉剂5.2g,NaHCO3 1.0g溶解于水中，培养液中加入磁性搅棒进行搅拌，补三蒸水至400ml; 3 加抗生素：溶液中加入青霉素0.06g；链霉素0.05g; 4 培养基中加入Hepes2.

15、8g,定容至00ml ； 5 无菌条件下,用30ml注射器抽取培养基，用0.22um滤器正压过滤，分装于100ml玻璃容器中，每瓶85ml左右，瓶口火焰灭菌，加塞； 6 将胎牛血清置于560c水浴箱中灭活30min, 正压过滤,分装; 7 抽取少许DMEM培养基放入培养瓶内，在370c,5%CO2温箱内置24-48h,以检测培养液是否有污染。余则放冰箱中冷冻备用。,配D-HANKS平衡盐溶液，作配胰蛋白酶用 步骤： 分析天平准确称量 kcl 0.4g Nacl 8.0g NaHCO3 0.35g Na2HPO4.H2O 0.1335g KH2PO4 0.06g 酚红 0.01g 加三蒸水溶解，补水至100ml, 磁性搅棒进行搅拌，调整pH至7.2左右。,三 配胰蛋白酶消化液 称取TYPSIN(1:250)0.25g,加入100mlD-HANKS液，磁力搅拌混匀，使其完全溶解。置4c冰箱过夜；次日，用0.22um滤器正压过滤，分装 。 四 配PBS液 NaCl 8.0g KCl 0.20g Na2HPO4H2O 1.56g KH2PO4 0.24g 加三蒸水100ml，8磅高压蒸汽灭菌15min，4冰箱保存。,第三部分 参观无菌培养室,1、取对数生长期的细胞，常规消化成细胞悬液并调整细胞浓度至1105/ml 2、以100l/孔接种96孔培养板，置37, 5%CO2的培养箱中培养