第二十一章-药物制剂的微生物学检查.ppt

1、第20章药物制剂的微生物学检查，药物制剂的微生物学检查主要包括无菌检查、细菌总数检查、霉菌总数检查、病原菌检查和螨虫检查等。 不同制剂的微生物学检查要求完全不同。 第一节无菌制剂无菌检查、无菌检查是检查药物制剂中是否存在活着的微生物的一种方法。 各种注射液(如注射剂、输液)、手术及眼科制剂必须保证不含有活微生物才能被视为合格。 否则，在临床使用时会导致不良后果。 一、无菌检查的基本原则、基本原则：采用严格的无菌操作方法，将检测的药品各接种一定量的适合各种微生物生长的不同培养基(通常是好氧菌培养基、厌氧菌培养基和真菌培养基)，在适当的温度下培养一定时间后，观察有无微生物生长，判断被检药品的合格与

2、否。 无菌检查采用部分采样结果估计整体菌含情况，被检样品的采样及程序必须符合国家药典标准。 二、无菌检查的基本方法；(一)一般药品的无菌检查一般药品的无菌检查采用直接接种法，即将检验品按规定量直接接种到适合好氧菌、厌氧菌和真菌生长繁殖的一定量的培养基中，同时在相同的培养基中进行阳性对照试验。 阳性对照实验证明微生物能够在实际应用的实验条件下生长。 中国药典采用金黄色葡萄球CMCC(B)26003、孢霉CMCC(B)64941、白念珠菌CMCC(F)98001作为好氧菌、厌氧菌和真菌的阳性对照株。 然后根据需要培养一定时间，好氧菌、厌氧菌在30-35培养5天，真菌在20-25培养7天。 在观察结

3、果时，阳性对照必须为长菌，才能判定检验品合格。 如果阳性对照管不是长菌，该药物可能具有抗菌作用，或有油剂等特殊制剂。 如果检验品是液体，可以直接放入培养基的固体药物，按规定加入一定量的无菌生理盐水或无菌水，使药物溶解在均匀的检验品溶液中，进行无菌检验。 (二)特殊药品的无菌检查，如果阳性对照相管没有细菌，必须进行特殊处理。 1、油类药物无菌检验一般油剂与普通培养基不混合，药品中微生物难以生长，一般可采用吐温培养基，其侥幸与普通药品无菌检验法相同。 吐温培养基的特征是培养基中的吐温80使油类药物均匀分散，增加培养基的机会，使微生物的检测变得容易。 2、对含有抗菌药物或防腐剂的药物的检查，如果被检

4、药物具有抗菌作用，则阳性对照管和试管都可能不产生菌，在进行无菌检查之前，必须在去除药物自身的抗菌作用之后进行无菌检查。 (1)加入灭活剂或对消剂，去除或抵消抗菌药物的抗菌作用。 但灭活剂本身对微生物无毒性，同时灭活剂与抗菌药相互作用后的产物对微生物也无毒性，灭活剂的作用必须迅速完整。 例如青霉素在进行无菌检查时加入使青霉素失活的无菌青霉素酶溶液。(2)微孔过滤法被检药品加入无菌生理盐水进行稀释，然后用无菌微孔过滤器(孔径0.22-0.45m )过滤，用无菌生理盐水充分清洗后，取出过滤器，分多片放入各种培养基中进行检查(4)离心沉淀法采取规定量的供试液抛弃清夜，保留底部浓缩菌液2ml左右，再稀释

5、一定量进行检查，即限制内服药及外用药的微生物总数和限制病原微生物种类的系列测定项目，我国规定项目有：细菌总数的测定、霉菌总数的测定、病原菌(大肠菌、金黄色葡萄球菌、绿脓菌、沙门氏菌) 判断合格与否的标准是，口服药和外用药中的微生物总量必须低于规定限量，口服药每克或每毫升必须含大肠杆菌、沙门氏菌。 外用药每克或每毫升不含铜绿假单细胞菌、金黄色葡萄球菌和破伤风杆菌。 也不能检测出生螨。 另一方面，细菌总数的测定，了解被检药品的单位重量或体积(每克或毫升)内含有的活菌数(实际上是好氧菌的活菌数)，判断供试剂被细菌污染的程度，是该药品生产过程整体卫生学综合评价的重要依据。 测定方法采用琼脂板计数法，将

6、一定量的供试剂用无菌生理盐水按比例系数稀释，将定量的稀释液放入无菌板中，再加入一定量的融化温度35左右的琼脂培养基进行搅拌，凝固后，培养37个小时，计数板内的菌落。 一般选择菌落数为30-300的平板进行计数，乘以稀释倍数，可以得到每克或每毫升的活菌总数。 二、霉菌和酵母菌总数的测定，考察供试剂中每克或每毫升含有的生霉菌和酵母菌总数，查明检验品被真菌污染的程度。 测定方法与细菌总数的测定方法一样，采用适于霉菌生长的虎红培养基。 用25-28培养72小时，平皿生长的菌落数在5-50个的范围是适当的，可以乘以稀释倍数，得到每单位重量(或体积)的真菌总数。 三、病原菌检查、病原菌检查原则：病原菌形态

7、和培养特征观察是鉴别的基本要求，生化反应、血清学反应、动物毒力试验等项目要求因菌而异。 常规检验程序包括药物准备、预处理增菌培养分离培养纯培养染色镜检验、生化试验、血清学试验、动物试验等结果判断。 5种病原菌的鉴别意义和检验要点，1、大肠杆菌是口服药品的常规必要检验项目。 药品的这种菌来源于人和温血动物的粪便。 从检查品中检出该菌，表明药品有可能被粪便污染，患者服用后，有感染肠道病原菌和寄生虫的危险。 因此，不能从口服药品中检测出大肠杆菌。 检验要点： (1)形态：革兰阴性短小无芽胞杆菌(2)分离培养：在伊红美兰(EMB )培养基中分解乳糖，产生紫黑色、金属光泽菌落。 (3)生化反应：乳糖发酵

8、试验：产酸产气剂或产酸产气剂IMVIC试验：-。 2、沙门氏菌、口服药物的必要检查项目，它主要寄生在人体和动物的肠道内，随粪便可污染水源、食品和药品，如伤寒、副伤寒、急性胃肠炎和败血症等人类疾病。 因此，内服药规定不能检测沙门氏菌。 检查要点： (1)形态革兰阴性短杆菌(2)分离培养： SS琼脂上沙门菌不分解乳糖，产生H2S，菌落无色透明或半透明，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，菌落中心呈黑褐色。EMB平板上的菌落呈无色或粉红色。 三糖铁培养(TSI )降解葡萄糖会产生酸气，不降解乳糖、蔗糖，有动力，产生黑色沉淀。 (3)生化反应：沙门氏菌的生化反应特性，葡萄糖乳糖麦芽糖醇蔗糖-吲哚V-P硫化氢

9、尿素酶氰化钾-赖氨酸动力，、(4)血清学反应，如果以可疑菌为抗原发生凝聚反应， 如果没有发生表明该菌可能是沙门氏菌的凝聚反应，则将菌液在100水浴中煮沸30分钟后(以破坏菌体外h抗原为目的)，进行凝聚反应，可以根据形态、菌落以及生化反应的结果进行综合判断。 表21-2沙门氏菌检查结果，血清凝集试验(A-F组抗o血清)号凝集反应10030分凝集反应阳性2阴性阳性3阴性0.9%氯化钠溶液对照生化试验的结果，阴性一致检测沙门氏菌阴性一致检测沙门氏菌不一致，3，绿脓菌，尤其是大面积烧伤、烧伤感染该菌后病情加重，患者伤口化脓，严重者常引起败血症，眼角膜溃疡失明。 因此，不能像眼科制剂和外伤药那样检测出这

10、种菌。 检查要点： (1)形态：革兰阴性短杆菌(2)分离培养：十六烷基溴化铵琼脂板上菌落扁平、不定形、湿润、周边扩散或扩散，灰白色，水溶性绿色色素扩散至培养基。 (3)生化反应：氧化酶试验阳性、绿脓菌试验阳性可报告检出该菌。 如果绿脓菌实验阴性，就需要明胶液化试验阳性、硝酸盐实验阳性、42生长试验阳性，受检品有该菌报道。 4、金黄色葡萄球菌是葡萄球菌属中致病力最强的菌，是人食物中毒症的常见病原体，可引起人体局部化脓感染，重症病例可引起败血症。 目前眼科制剂和外用药规定不可检测该菌。 检查要点： (1)形态：革兰氏阳性球菌，葡萄状排列。 (2)分离培养和生化试验蛋黄高盐培养基甘露醇高盐培养基菌落

11、特征金黄色、圆形突起金黄色、圆形突起边缘整齐、边缘整齐的周边乳浊圈周边有黄色环生化试验甘露醇血浆凝固酶，以5、破伤风杆菌、植物根、茎为原料的药品多受破伤风梭菌的污染。 感染该菌可引起破伤风，死亡率达50%以上。 因此，用于深部组织、创伤和溃疡面的外用药不能检测该菌。 检查要点：(1)形态：克阳性芽胞梭菌，菌体细长，带芽胞菌体呈鼓槌状，有周鞭毛，可运动，不形成荚膜。 (2)分离培养：葡萄糖疱肉培养基，消化肉渣，使肉渣变黑，有特殊臭味。 新霉素葡萄糖血平板上菌落扩散生长，呈雾状、细丝状或羽毛状，边缘不齐，常有溶血环。 (3)毒性试验：大鼠批次注射菌液，648观察发病情况。 出现典型破伤风病并判定阳性。 为了证明小鼠是否为破伤风外