第二章 酶的结构与功能.ppt

1、,第二章,酶的结构与功能,在生物化学发展历史上，酶学是个经久不衰的主题，一方面，代谢途径及其调控机制的阐明有赖于关键酶的分离、纯化及其动力学和调控的研究，另一方面，许多酶又是研究蛋白质、核酸和聚糖结构与功能的重要工具。随着生物化学和分子生物学相关领域以及其它学科的发展，尤其是结构生物学、蛋白质组学、基因工程、蛋白质工程和免疫学的理论和技术向酶学的渗透，为酶学发展注入新的活力。当前，酶学发展主要有两大方向：即分子酶学和应用酶学。分子酶学重点研究酶的分子生物学，酶的分子结构、作用机制和调控，酶的合成、分拣、转运和定位等。应用酶学则包括酶法分析、酶工程、组织酶学、药理酶学、食品酶学等。,2.1.酶促

2、反应动力学,化学热力学说明反应的起点和终点，解决反应的方向和限度。动力学研究反应速度及各种因素如何定量地影响反应速度。酶仅在热力学允许的范围内加速反应进程，或将耗能反应与放能过程相偶联。,2.1.1 单底物酶促反应动力学,2.1.1.1 MichaelisMenten方程：,2.1.1.2 Km和Vmax的意义,2.1.1.3 催化常数（Catalytic constant, Kcat）或转换数（turnover number,TN） 常用Kcat/Km表示酶的催化效率，为酶专一性的定量尺度。,2.1.1.4 作图法求Km和Vmax,（1）Lineweaver-Burk作图法： （2）Eadi

3、e-Hofstee作图法： （3）Hanes-Woolf作图法： （4）Eisenthal和Cornish-Bowden作图法,2.1.2 多底物酶促反应的动力学,2.1.2.3 双底物产物反应的动力学方程,2.1.2.1 Cleland命名与表示法,双底物双产物酶促反应动力学分类,2.1.2.2,（2）序列随机反应,（1）序列有序反应,（1）乒乓机制的反应动力学及作图,（2）序列机制的反应动力学方程及作图,（3）乒乓反应,序列有序反应,序列随机反应,乒乓反应,乒乓机制的反应动力学及作图,序列机制的反应动力学方程及作图,2.2 酶的抑制作用,凡能降低酶催化活性的物质均可认为是酶的抑制剂。酶在抑

4、制剂作用下活力下降甚至丧失，称为抑制作用。 （1）抑制程度表示方法： （2）抑制作用的分类： （3）不可逆抑制与可逆抑制的鉴别：,2.2.1 可逆抑制作用,2.2.1.1 竞争性抑制,图2.10 竟争性抑制的二次作图,竞争性抑制,竞争性抑制 的双倒数作图,氨甲喋呤,四氢叶酸,水合型,水合型瞟,水合型嘌呤核糖核苷,2003年美国FDA批准的抗HIV药是HIV蛋白酶抑制剂,过渡态（transition state）底物（S）比基态底物（S）更易与酶结合并形成产物，因而过渡态类似物比一般的底物类似物有更强的抑制效应。 2.2.1.2 非竞争性抑制 2.2.1.3 反竞争性抑制 2.2.1.4 混合性

5、抑制 表2.2 几种同位抑制作用动力学的比较 表2.3 双底物反应中同位可逆抑制剂的抑制类型 2.2.1.5 底物抑制与产物抑制,反竞争性抑制,混合性抑制,混合性抑制 的双倒数作图,2.2.2 不可逆抑制作用,2.2.2.1 非专一性不可逆抑制剂：主要有以下几类 （1）有机磷化合物 （2）有机汞、有机砷化合物 （3）烷基化试剂 （4）青霉素、头孢霉素 （5）氰化物、硫化物和CO （6）重金属盐Ag+、Cu2+、Hg2+、Pb2+等重金属离子,胰蛋白酶与牛胰胰蛋白酶抑制剂的复合物,2.2.2.2 专一性不可逆抑制剂,（1）KS型专一性不可逆抑制剂（活性部位定向抑制剂或亲和标记试剂）：部分结构与底

6、物类似，可直接结合于活性部位，另一部分则与活性中心某基团反应，对其进行共价修饰使E失活，如TPCK对胰凝乳蛋白酶。 （2）Kcat型专一性不可逆抑制剂（自杀性底物，suicide substrate）：具有类似于底物的结合和反应基团，可结合于酶的活性部位并在其作用之下发生反应；与底物不同的是它还有潜伏的反应基团，受酶催化之后即被活化，与酶活性中心某基团共价结合，使酶丧失活性。,KS型专一性不可逆抑制剂,对甲苯磺酰L苯丙氨酰氯甲基酮（TPCK）,对甲苯磺酰L苯丙氨酰氯甲基酮（TPCK）,对甲苯磺酰L苯丙氨酰氯甲基酮（TPCK）,Kcat型专一性不可逆抑制剂,2.3 酶的作用机制,酶催化的专一性包

7、括底物结合专一性和催化作用专一性。前者要求酶选择与其活性部位的几何形状和大小相吻合的底物；后者要求底物具备合适的键或基团，在ES中与酶的催化基团间有足够大的作用力。底物结合专一性与KS相关，而Kcat/Km反映催化专一性。,2.3.1 酶的活性中心,2.3.1.1 活性中心的特点：仅占酶分子总体积的一小部分（通常约12%），催化中心一般由23个残基（和辅因子）组成，最常见的残基如His、Ser、Asp等。结合中心因酶而异；活性中心的三维结构由其一级结构决定，与特定的环境有关，凡破坏蛋白质构象的因素（变性）均使酶失活；酶在与底物结合的过程中相互诱导，使酶的活性中心的几何形状和大小与底物相吻合（互

8、补），催化基团与底物反应基团定向靠近；活性中心通常在酶分子表面疏水的裂隙或凹陷中。,溶菌酶的结构,溶菌酶多肽链上活性中心残基的位置,2.3.1.2 研究酶活性中心结构的方法,（1）化学修饰法 非专一性修饰试剂仅用于初筛 差示标记法 亲和标记 （2）动力学参数测定可为了解酶活性中心的结构提供有关信息。 （3）X-射线晶体衍射仍是迄今最主要的研究大分子三维结构的技术手段。 （4）分子生物学方法已广泛用于酶结构的研究。,亲和标记,乙酰胆碱酯酶,二异丙基氟磷酸,2.3.2 酶的催化机制：对酶作用高效性作出贡献的基元反应,2.3.2.1 底物的邻近效应（approximation）和定向效应 2.3.2

9、.2 广义酸碱催化 2.3.2.3 共价催化 2.3.2.4 诱导契合与底物扭曲,邻近效应与定向效应,ATP,Adenylate Kinase,.Adenylate Kinase.ATP,以,2.3.3 酶促反应机制实例 以研究得最为深入的胰凝乳蛋白酶为例,胰凝乳蛋白酶的催化三元组,底物与酶结合时，疏水侧链进入酶的底物结合部位疏水蛋袋,底物与酶结合时，肽链疏,底物与酶结合时，大的芳香族侧链进入酶的底物结合部位疏水袋内，恰好让敏感肽键处于易受攻击的位置。,活性中心的Ser-195与His-57相互作用，在Ser-195上生成一个强烈亲核的醇盐离子，随即对敏感肽键碳原子进行亲核攻击，形成正四面体酰

10、基化酶。与此相伴，底物C=O氧形成一个短命的负电荷，通过H结合于氧阴离子洞，使之得以稳定。,底物C=O氧上负电荷的不稳定性导致四面体中间物瓦解；重新形成与碳原子间的双键，代替碳与肽键氨基间的键，使得肽键裂解。His-57促使产物1的氨基质子化，以利于它从酶上释放。,通过广义碱催化，进入活性中心的水分子去质子化，形成强有力的亲核氢氧离子。氢氧离子对酰基化酶的酯键进行攻击， 氧阴离子洞再次获得一个负电荷。,酰基化酶中间物随即去酰基化，生成短寿命的中间物。,短寿命的四面体中间物瓦解，形成第二个产物，一个羧酸阴离子，置换出Ser-195。,Asp-102的负电荷与第二种产物羧基阴离子间的静电斥力有助于

11、该产物离开酶的活性部位，酶又回到游离状态。,酶活性的调节,2.4 酶活性的调节,新陈代谢受到精密灵活高效的调控，调控作用在不同层次上进行，其中最基本的是对酶的数量和酶活性的调控。以下重点介绍酶活性调节的分子机理。 2.4.1 别构酶 E.coli天冬氨酸转氨甲酰酶（ATCase）的别构调节效应。这种酶分子由6个催化亚基和6个调节亚基组成（图2.18）。,E.coli天冬氨酸转氨甲酰酶(ATCase),2.4.1.1 协同效应：,S曲线：正协同81V随S而加快,a 、仅底物是别构调节物,双曲线：负协同81V随S而减慢,b、当其他别构物参与调节时,整体上产生激活、抑制现象,改变了调节的敏感区位置,

12、图2.20 正、负协同别构酶与非别构酶的动力学曲线比较,2.4.1.2 别构酶的一般特性：,2.4.1.3 别构酶的调节,（1）齐变模型（concerted modle）或对称（symmetry）模型,（2）序变模型,图2.26 别构酶的序变模型,2.4.2 共价修饰调节酶,（1）酶原激活： （2）可逆的共价修饰：,共价修饰调节酶的级联放大效应,2.4.4 酶活性的其它调节方式,（2）通过与细胞骨架或细胞器表面的缔合 解离调节酶活性 （1）寡聚酶通过聚集 解聚调节活性： （3）有些酶的调节亚基具有抑制蛋白或改性亚基的功能，或者有接应蛋白的功能，催化亚基可逆地与这样的调节亚基结合对活性进行调控。

13、,2.4.5 酶活性调节实例,2.4.5.1 天冬氨酸转氨甲酰酶,2.4.5.3 E.coli谷酰胺合成酶,2.4.5.4 6-磷酸果糖-1-激酶(6-phosphofructo-1-Kinase, 6PF-1-K)/果糖1，6-二磷酸酶(fructose-1,6-bisphosphatase,Fru-1,6-P2ase),图 2.31 可逆磷酸化对6PF-2，6-P2ase活性的调节 图2.32 糖酵解与糖异生途径的协调控制,糖酵解与糖异生途径的协调控制,可逆磷酸化对6PF-2，6-P2ase活性的调节,2.4.5.5 Pyruvate Dehydrogenase Complex,原核生物的丙酮酸脱氢酶复合物