质粒载体.ppt

1、三、原核生物的质粒,定义：是一类小型闭合环状核外双螺旋DNA分子，能独立于细胞核进行自主复制。 大小：约为2100106Dalton，上面携带有数个到数十个甚至上百个基因。 性质： 可以在细胞质中独立于染色体之外独立存在（游离态），也可以通过交换掺入染色体上，以附加体（episome）的形式存在； 质粒是一种复制子（replicon），根据自我复制能力的不同，可把质粒复制的控制形式分为严紧型和松弛型两种，严紧型质粒的复制受细胞核控制，与染色体DNA复制相伴随,一般一个寄主细胞内只有少数几个（15）个拷贝；松弛型质粒的复制不受细胞核控制，在染色体DNA复制停止的情况下仍可以进行复制，在细胞内的数

2、量可以达到10200个或更多。,可以通过转化、转导或接合作用而由一个细菌细胞转移到另一个菌细胞中，使两个细胞都成为带有质粒的细胞；质粒转移时，它可以单独转移，也可以携带着染色体（片段）一起进行转移，所以它可成为基因工程的载体。 对于细菌的生存并不是必要的 功能多样化,三、原核生物的质粒,功能：进行细胞间接合，并带有一些基因，如产生毒素、抗药性、固氮、产生酶类、降解功能等。 重组：在质粒之间、质粒与染色体之间菌可发生。 存在范围：很多细菌如E.coli、Shigella、S.aureus、Streptococcus lactis、根癌土壤杆菌等 制备：包括增殖、裂解细胞、分离质粒与染色体和蛋白质

3、等成分、去除RNA和蛋白质等步骤。 鉴定：电镜观察、电泳、密度梯度离心、限制性酶切图谱等方法,三、原核生物的质粒,几种代表性质粒：,1. F因子（fertility factor）：又称致育因子或性因子，62106Dalton，94.5kb，相当于核染色体DNA2%的环状双链DNA，足以编码94个中等大小多肽，其中1/3基因（tra区）与接合作用有关。存在于肠细菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌、奈瑟氏球菌、链球菌等细菌中，决定性别。,Figure. Representative FERTILITY PLASMID. A fertility plasmid carries the genes for

4、conjugation as well as a number of other genes. In this figure the fertility plasmid also carries antibiotic resistant genes.,最初发现于痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae），后来发现还存在于Salmonella、Vibrio、Bacillus、Pseudomonas和Staphylococcus中。 R因子由相连的两个DNA片段组成，即抗性转移因子（resistence transfor factor， RTF ）和抗性决定R因子（r-determi

5、nant），RTF为分子量约为11106Dalton，控制质粒copy数及复制，抗性决定质粒大小不固定，从几百万到100106Dalton以上。其上带有其它抗生素的抗性基因。 R-因子在细胞内的copy数可从12个到几十个，分为严紧型和松弛型两种，经氯霉素处理后，松弛型质粒可达20003000个/细胞。,2. R因子（resistence factor）,产大肠杆菌素因子。 大肠杆菌素是由E.coli的某些菌株所分泌的细菌素，能通过抑制复制、转录、转译或能量代谢等而专一地杀死其它肠道细菌。其分子量约41048104Dalton。大肠杆菌素都是由Col因子编码的。 Col因子可分为两类，分别以C

6、olE1和ColIb为代表。 ColE1分子量约为5106Dalton，无接合作用，是多copy的； ColE1研究得很多，并被广泛地用于重组DNA 的研究和用于体外复制系统上。 ColIb分子量约为80106Dalton，它与F因子相似，具有通过接合作用转移的功能，属于严紧型控制，只有12个copy。 凡带Col因子的菌株，由于质粒本身编码一种免疫蛋白，从而对大肠杆菌素有免疫作用，不受其伤害。,3. Col因子（colicinogenic factor）,降解性质粒 只在假单胞菌属中发现。它们的降解性质粒可为一系列能降解复杂物质的酶编码，从而能利用一般细菌所难以分解的物质做碳源。这些质粒以其

7、所分解的底物命名，例如有分解CAM（樟脑）质粒，XYL（二甲苯）质粒，SAL（水杨酸）质粒，MDL（扁桃酸）质粒，NAP（奈）质粒和TOL（甲苯）质粒等。,4. 降解性质粒,即诱癌质粒。 存在于根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）中,可引起许多双子叶植物的根癌 。当细菌侵入植物细胞中后，在其细胞中溶解，把细菌的DNA释放到植物细胞中。这时，含有复制基因的Ti质粒的小片段与植物细胞中的核染色体发生整合，破坏控制细胞分裂的激素调节系统，从而使它转变成癌细胞。 Ti质粒长200kb，是一个大型质粒。当前，Ti质粒已成为植物遗传工程研究中的重要载体。一些具有重要性状的外源

8、基因可借DNA重组技术设法插入到Ti质粒中，并进一步使之整合到植物染色体上，以改变该植物的遗传性，达到培育植物优良品种的目的。,5. Ti质粒（tumor inducing plasmid）,是近年来在Rhizobium（根瘤菌属）中发现的一种质粒，分子量为200300106Dalton，比一般质粒大几十倍到几百倍，故称巨大质粒，其上有一系列固氮基因。,6. 巨大质粒（mega质粒）,基因：能够表达和产生基因产物（蛋白质或RNA）的DNA序列。,原核生物基因系统： 启动子（基因） 操纵子 操纵子（基因） 基因调控系统 结构基因 调节基因,细胞水平：大部分或全部DNA都集中于细胞核或核质体中，不

9、同种类微生物或同种不同细胞中细胞核的数目不同,染色体水平：真核微生物的每个细胞核内含有一定数量的染色体；而原核微生物中一个核质体就是一个裸露的、光学显微镜下不能看到的环状染色体。,一些真核生物和原核生物基因组的比较,生 物 单倍体的分子量 核苷酸 已知染色体数 约数（Da） 对数 基因数 人 32 35 1012 57 109 4000 黑腹果蝇 4 7.9 1010 8.0 107 50006000 粗糙脉孢菌7 2.8 1010 4.5 107 500 大肠杆菌1 2.5 109 3.8 106 1027 噬菌体T41 1.1 108 2.0 105 135 噬菌体1 3.2 107 4.

10、8 104 35 噬菌体MS21 1.1 106 3.5 103 3,遗传密码：指DNA链上各个核苷酸的特定排列顺序,密码子（coden）：由3个核苷酸顺序决定，负载遗传信息的基本单位 不对称转录：只有DNA双链的一股才作为有意义链被转录，这种现象又称不对称转录。 起始密码子：AUG，甲硫氨酸或甲酰甲硫氨酸 终止密码子：UAA、UGA、UAG,核外DNA的种类,核外染色体,真核生物的“质粒” 原核生物的质粒,线粒体 细胞质基因叶绿体 （质体）中心体 动 体 共生生物：卡巴颗粒 酵母菌的2m质粒,F因子 R因子 Col质粒 Ti质粒 巨大质粒 降解性质粒,第二节 基因突变和诱变育种,突变（ mu

11、tation ）：指生物体的表型突然发生的可遗传的变化。 染色体畸变细胞学上可以看到染色体的变化 突变 基因突变细胞学上看不到遗传物质的变化 突变体（mutant）：发生了突变的微生物细胞或菌株 野生型（wild type）：从自然界分离到的任何微生物在其发生突变前的原始菌株,依表型的改变分为： 形态突变型 营养缺陷型因突变而丧失产生某种生物合成酶的能力，并因而成为必须在培养基中添加某种物质才能生长的突变类型。 发酵突变型丧失产生某种生物合成酶能力的突变型 抗性突变型因突变而产生了对某种化学药物或致死物理因子的抗性 条件致死突变型突变后在某种条件下可正常生长繁殖，而在另一条件下却无法生长繁殖的

12、突变型 抗原突变型因突变而引起的抗原结构发生改变 产量突变型,（一）基因突变的类型,按是否比较容易、迅速地分离到发生突变的细胞来分： 选择性突变株（selective mutant）：具有选择标记（如营养缺陷性、抗性突变型、条件致死突变型），只要选择适当的环境条件，如培养基、温度、pH值等，就比较容易检出和分离到。 非选择性突变株（non-selective mutant）：无选择标记（如产量突变型、抗原突变型、形态突变型），能鉴别这种突变体的惟一方法是检查大量菌落并找出差异。,定义：每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率。 突变率为108是指该细胞在一亿次细胞分裂中，会发生一次突变。突变

13、率也可以用每一单位群体在每一世代中产生突变株（mutant，即突变型）的数目来表示。如一个含108个细胞的群体，当其分裂为2108个细胞时，即可平均发生一次突变的突变率也是108 。 突变率=突变细胞数/分裂前群体细胞数 突变是独立的。某一基因发生突变不会影响其它基因的突变率。在同一个细胞中同时发生两个基因突变的几率是极低的，因为双重突变型的几率只是各个突变几率的乘积。 由于突变的几率一般都极低，因此，必须采用检出选择性突变株的手段，尤其是采用检出营养缺陷型的恢复突变株（back mutant或reverse mutant）或抗性突变株特别是抗药性突变株的方法来加以确定。,（二）突变率,若干细

14、菌某一性状的自发突变率,菌 名 突变性状突变率 E. coli抗T1噬菌体3 108 E. coli抗T3噬菌体1 107 E. coli不发酵乳糖1 1010 E. coli 抗紫外线1 105 Staphylococcus aureus 抗青霉素1 107 S. aureus 抗链霉素1 109 Salmonella typhi抗25g/L链霉素1 106 Bacillus megaterium 抗异烟肼5 105,（三）突变的特点,适用于整个生物界，以细菌的抗药性为例。 不对应性：突变的性状与突变原因之间无直接的对应关系。 自发性：突变可以在没有人为诱变因素处理下自发地产生。 稀有性：突

15、变率低且稳定。 独立性：各种突变独立发生，不会互相影响。 可诱发性：诱变剂可提高突变率。 稳定性：变异性状稳定可遗传。 可逆性：从原始的野生型基因到变异株的突变称为正向突变（forward mutation），从突变株回到野生型的过程则称为回复突变或回变（back mutation或reverse mutation）。,（四）基因突变的自发性和不对应性的证明,在各种基因突变中，抗性突变最为常见。但在过去相当长时间内对这种抗性产生的原因争论十分激烈。 一种观点认为，突变是通过适应而发生的，即各种抗性是由其环境（指其中所含的抵抗对象）诱发出来的，突变的原因和突变的性状间是相对应的，并认为这就是“定

16、向变异”，也有人称它为“驯化”或“驯养”。 另一种看法则认为，基因突变是自发的，且与环境是不相对的。由于其中有自发突变、诱发突变、诱变剂与选择条件等多种因素错综在一起，所以难以探究问题的实质。 从1943年起，经过几个严密而巧妙的实验设计，主要攻克了检出在接触抗性因子前已产生的自发突变株的难题，终于解决了这场纷争。,变量试验又称波动试验或彷徨试验。 1943年，S. E. Luria 和M. Delbrck 根据统计学原理，设计了左方的实验。,1. 变量试验fluctuation test,2.涂布试验,原理与变量试验相同，方法更为简便，且可计算突变率。,涂布试验中突变率的计算,初始接种量：5

17、 104 个/皿 培养5小时，繁殖了12.3代，每个微菌落约含5100个细菌 这时，每个平皿上的细胞数为： 5100 5 104 2.6 108个/皿 在6个平板上，比接种时增加的细胞数为： 6 （2.6 108 5 104）= 15.6 108 在未涂布的平板上共发现28个突变，故 突变率 = 28/15.6 108 = 1.8 108,3. 平板影印培养试验（replica plating）,1952年，J. Lederberg夫妇的论文平板影印培养法和细菌突变株的间接选择，更好地证明了微生物的抗药性是在未接触药物前自发地产生的，这一突变与相应药物环境毫不相干。 平板影印培养法，是一种能达到在一系列培养皿的相同位置上出现相同遗传型菌落的接种培养方法：把长有许多菌落的母种培养皿倒置于包有灭菌丝绒布的木质圆柱印章上，使其沾上来自平板上的菌落。然后可把这一“印章”上的菌落一一接种到不同的选择性培养基平板上。待这些平板培养后，对各平板相同位置上的菌落作对比后，就可选出适当的突变型菌株。据报道，用