PCR技术及其延伸与应用.ppt

1、PCR技术在医学领域的应用,聚合酶链反应或多聚酶链反(Polymerase Chain Reaction, PCR）又称无细胞克隆技术(“free bacteria”cloning technique) 特定的DNA片段在体外进行快速扩增的新方法。 在数小时内可使几个拷贝的模板序列甚至一个DNA分子扩增107108倍，大大提高了DNA的得率。,PCR技术最早由美国Cetus公司人类遗传研究室Kary Mullis及同事于1985年发现并研制成功的； 最早的应用报道是Saiki等1985年将PCR技术应用于-珠蛋白基因扩增和镰刀状红细胞贫血的产前诊断。 使用1976年Chien等分离的热稳定性T

2、aq DNA聚合酶，使PCR操作大为简化，并使PCR自动化成为可能； 1987年Kary Mullis等完成了自动化操作装置，使PCR技术进行实用阶段。,PCR已获得广泛应用,目前，每年都有上千篇文章发表。 1991年，期刊“PCR方法与应用”（PCR Methods and Application）在美国创刊，使有关学者有了自己的论坛和参考的专业期刊。 Kary Mullis因发明了“聚合酶链式反应”而获得1993年度诺贝尔化学奖。(一名加拿大籍英国科学家Michael Smith因开创了“寡核苷酸基因定点诱变”的方法而与Mullis同享此荣),PCR技术检测细菌,鸭疫里默氏杆菌 霍乱弧菌

3、食源性病原细菌 结核杆菌,PCR与病毒类疾病应用,杂交法检测植物病毒和类病毒 利用RT-PCR对黄瓜病毒源种类进行检测 诊断人类乳头状病毒HPV感染,诊断遗传疾病,PCR的特点,特异性高-聚合酶 首次报导用大肠杆菌的DNAPolymerase I的Klenow大片段。90会变性失活，需每次PCR循环都要重新加入；同时引物是在37延伸 Taq DNA聚合酶 1988年Saiki等从温泉水中分离到的水生嗜热杆菌中提取的热稳定的，扩增过程中，单核苷酸的错误参入程度很低、其错配率一般只有约万分之一,高度敏感： 理论上PCR可以按2n倍数扩增DNA十亿倍以上。 应用证实可以将极微量的靶DNA成百万倍以上

4、地扩增到足够检测分析量的DNA。 能从100万个细胞中检出一个靶细胞，或对诸如病人口液等只含一个感染细胞的标本或仅含0.01pg的感染细胞的特异性片段样品中均可检测。,快速 简便 可扩增RNA或cDNA,试剂,引物：决定扩增的特异性。根据检测的DNA不同，选用不同引物。 耐热的DNA聚合酶： 10PCR缓冲液500mmol/lKCl;100mmol/L Tris-HCl(pH8.4,20)150mmol/L MgCl2,1mg/ml明胶。 dNTP贮备液 DNA模板,操作程序,试剂混合 PCR仪程序设计：94变性30s，55退火20s，然后在72延伸30s，共循环30-35次。最后一次循环结束

5、后，再将反应管置72温育5min，以确保充分延伸。,PCR反应基本条件及其对PCR的影响,模板核酸 有机溶剂酚 蛋白质污染 核酸污染 核酸的量,引 物,引物与PCR的特异性， 引物限定扩增产物的大小。 合成的引物必须经聚丙烯酰胺凝胶电泳或反向高压液相层析（HPLC）纯化。 冻干引物于-20至少保存12-24个月，液体状态于-20可保存6个月。引物不用时应存于-20保存。,缓冲液,缓冲液的目的：给Taq DNA聚合酶提供一个最适酶催反应条件。 目前最为常用的缓冲体系为10-50mmol/LTris-HCl (Tris是一种双极性离子缓冲液，pH变化于6.8-7.8之间。将Tris浓度加大到50m

6、mol/L，pH8.9,有时会增加产量。 50mmol/L以内的KCl，50 mmol/L以上的KCl则抑制Taq DNA聚合酶的活性。有些反应液中以NH+4代K+。 反应中加入小牛血清白蛋白（100g/ml）或明胶（0.01%）或Tween 20（0.05% 0.1%） 5mmol/l 的二硫苏糖醇（DTT）有助于酶的稳定，尤其在扩增长片段（此时延伸时间长）时。,Mg2+,Mg2+浓度直接影响着酶的活性与忠实性。影响着引物的退火，模板与PCR产物的解链温度引物二聚体的形成等。 Mg2+浓度过低时，酶活力显著降低；过高时，通常会导致非特异性扩增产物的累积。 Taq DNA聚合酶需要的是游离Mg

7、2+ 。 DNA模板，引物和dNTP 的磷酸基团均可与Mg2+结合，降低Mg2+实际浓度。,三磷酸脱氧核苷酸dNTP,dNTP是DNA合成的基本原料。 含量太低，PCR扩增产量太少、易出现假阴性。 dNTP浓度过高会导致其错误掺入（即所谓的“热力背信”）。一般认为最适的dNTP浓度为50200mol/L。 dNTP的质量也直接影响PCR反应的成败。,耐热DNA聚合酶,Taq DNA聚合酶取代了大肠杆菌DNA聚合酶I大片段使 PCR得到广泛应用。 Taq DNA聚合酶是从水生栖热菌Thermus Aquaticus（Taq）中分离出的热稳定性DNA聚合酶。 Taq DNA聚合酶简化了PCR程序,

8、增加了PCR特异性及PCR扩增效率。该酶的最适温度很高（79）， 100l反应液中含1-2.5u Taq DNA聚合酶为佳， Taq DNA聚合酶保存不当而失活是PCR实验失败的常见原因。,温度循环参数,变性温度与时间 复性温度与时间 延伸温度与时间 循环数：,PCR实验中常见问题对策,假阴性问题 假阳性问题。,假阴性,Taq DNA聚合酶活力不够，或活性受到抑制 引物设计不合理 提取的模板质量或数量不过关以及 PCR系统欠妥当 循环次数不够,假阳性,微量的靶基因污染 标本间的交叉污染 样品中存在有靶基因的同源序列 PCR操作时要隔离不同操作区、分装试剂、简化操作程序，使用一次性吸头。,PCR

9、技术的延伸,PCR是一种技术和方法，在使用中不同的人根据自己的试验目的、结合自己的知识背景、研究、创造了不同的PCR方法，开拓了PCR应用的新领域。现在至少有15种不同的PCR用于不同的试验。,反转录PCR-Reverse transcription PCR,一种检测底丰度特异 的方法 互补靶cDNA生成 双链靶DNA 扩增靶DNA,RTPCR反应体系,PCR的反应体系但是模板是RNA RNA酶抑制剂RNasin 反转录酶 禽酶禽类成髓细胞性白血病病毒(Avian myeloblastosis virus,AMV) 鼠酶莫洛尼鼠白血病病毒(moloney murine leukemia virus),Touch down PCR,一般PCR的体系 一般PCR的设计原理 不同的PCR过程 目的：在不知道理想退火温度的条件下保证扩出产物,梯度PCR,在特殊PCR仪上进行的一般PCR 目的：寻找最佳的退火温度 与TouchDown PCR的区别 TD PCR：对同一PCR体系采用不同的退火 温度进行 PCR循环 梯度PCR：同时对多个PCR体系采用不同的退火温度进行PCR循环,巢（套）式PCR-nested Primer PCR,不同的PCR体系两对引物 不同的PCR过程两段循环 目的：增加