第三章-蛋白质5-6.ppt

1、第三章 蛋白质,第三章 蛋白质,3.1 氨基酸、多肽和蛋白质 3.2 氨基酸 3.3 多肽 3.4 蛋白质 3.5 蛋白质的结构 3.6 多肽的化学合成,3.5 蛋白质的结构,一级结构，指蛋白质分子中的氨基酸的排列顺序。 二级结构，指蛋白质多肽链的主链骨架中的若干肽段的构象排列。 三级结构，指多肽链在二级结构的基础上，各原子的空间排布，包括侧链基团的取向，是二级结构的基础上范围更广的盘旋和折叠。 四级结构，是指多条肽链组成的一个蛋白质分子时，各亚单位在寡聚蛋白质中空间排布及亚单位间的相互作用。,3.5.1 蛋白质的一级结构,蛋白质的一级结构(Primary structure)包括： 组成蛋白

2、质的多肽链数目 多肽链的氨基酸顺序（蛋白质生物功能的基础 ） 多肽链内或链间二硫键的数目和位置。,主要研究内容： 1、氨基酸是如何连接成蛋白质， 2、对于一定的蛋白质,氨基酸的排列顺序。 3、蛋白质r的一级结构测定过程。,意 义,研究蛋白质的一级结构是研究蛋白质结构与功能的基础，这是因为Pr的一级结构决定了它的高级结构，从而决定了蛋白质的生物功能。 一级结构的研究为生物进化提供了依据， 不同生物的同一种蛋白的其一级结构是不同的。 一级结构的研究为一些分子病的诊断提供了依据。 只有将蛋白质的一级结构研究清楚后，生化工作者才能站到一个优越的地位去洞察，研究生命过程中的许多复杂问题。,镰刀状细胞贫血

3、病（血红蛋白分子病）,蛋白质的一级结构,组成蛋白质的多肽链数目 多肽链的氨基酸顺序（蛋白质生物功能的基础 ） 多肽链内或链间二硫键的数目和位置。,二硫键,在2-巯-乙醇、二硫苏糖类、巯基乙酸等的硫化合物与尿素那样的变性剂同时存在下使之发生作用，使还原成SH基（为了防止再氧化通常用适当的SH试剂将该基团烷基化） 在过甲酸的氧化作用下衍生成-SO3H基 采用在氧化剂共存下用亚硫酸的作用诱导成-S-SO3H基的方法。,二硫键,蛋白质一级结构的测定,蛋白质一级结构测定的一般步骤： 确定多肽链的数目 测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系可确定多肽链的数目 拆分多肽链 几条多肽链借助非共价键

4、连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基). 测定多肽链的氨基酸组成 酸水解成多肽，并计算出各种氨基酸的分子比 测定多肽链的氨基酸顺序,多肽链的氨基酸顺序分析,多肽链的选择性降解 酶解法（利用某些蛋白水解酶，进行选择性降解。） 化学法（溴化氰水解法：切割甲硫氨酸（Met）的羧基形成的肽键） 多肽链末端氨基酸测定 鉴定N-端氨基酸： 二硝基氟苯（DNFB）法又称Sanger法 丹磺酰氯法（DNS）法 Edman氨基酸顺序分析法(多肽氨基酸顺序自动分析仪) 鉴定C-端氨基酸： 肼解法,酶解法,溴化氰水解法

5、,选择性地降解由甲硫氨酸的羧基形成的肽键,二硝基氟苯（DNFB）法,Sanger法： 2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。,丹磺酰氯法,在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。 此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9mol。,Edman氨基酸顺序分析法,Edman氨基酸顺序分析法,（1）耦联,Edman氨基酸顺序分析法,（2）裂解,Edma

6、n氨基酸顺序分析法,（3）转化（ATZ不稳定，转化成PTH-aa),多肽氨基酸顺序自动分析仪,仪器原理：Edman法。 1967液相测序仪：旋反应器，适于大肽段。 1971固相测序仪：表面接有丙氨基的微孔玻璃球，可耦连肽段的端。 1981气相测序仪：用Polybrene反应器。,肼解法,此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。,练习,根据以下实验结果,推断一条多肽链的氨基酸顺序. 1).酸水解得知氨基酸的组成:2Ala;Arg;2Lys;Met;Phe;2Se

7、r. 2).羧肽酶A水解得:Ala. 3).胰蛋白酶水解得四肽段,其氨基酸组成如下: (1).Ala;Arg. (2).Lys;Phe;Ser. (3).Lys. (4).Ala;Met;Ser. 4).溴化氰裂解得两个肽段,其氨基酸组成如下: (1).Ala;Arg;2Lys;Met;Phe;Ser. (2).Ala;Ser. 5).嗜热菌蛋白酶水解得两个肽段,其氨基酸组成如下: (1).Ala;Arg;Ser. (2).Ala;2Lys;Met;Phe;Ser.,Ala-Arg-Ser-Phe-Lys-Lys-Met-Ser-Ala,1).酸水解得知氨基酸的组成:2Ala;Arg;2Lys

8、;Met;Phe;2Ser. 2).羧肽酶A水解得:Ala. 3).胰蛋白酶水解得四肽段,其氨基酸组成如下: (1).Ala;Arg. (2).Lys;Phe;Ser. (3).Lys. (4).Ala;Met;Ser. 4).溴化氰裂解得两个肽段,其氨基酸组成如下: (1).Ala;Arg;2Lys;Met;Phe;Ser. (2).Ala;Ser. 5).嗜热菌蛋白酶水解得两个肽段,其氨基酸组成如下: (1).Ala;Arg;Ser. (2).Ala;2Lys;Met;Phe;Ser.,嗜热菌蛋白酶：疏水、芳香氨基酸残基N端， Phe, Trp, Tyr, Leu, Ile, Val，羧基

9、是Pro、Gly时不作用。,Ala,（1）AlaArg；（2）Phe;SerLys (3).Lys. (4).Met;SerAla（C末端）.,(1).Ala;Arg;2Lys;Met;Phe;Ser. (2).MetSer Ala,AlaArgSerPheLys LysMetSerAla,3.5.2 蛋白质的三维结构,生物体内蛋白质的多肽链并不是一条简单的线形序列,而是折叠成具有生物学活性的形状蛋白质的三维结构 (空间结构) 蛋白质空间结构的研究方法 (1) X-射线衍射法（X-ray diffraction method） (2) 核磁共振（NMR） (3) 光谱法（红外光谱、紫外差光谱、

10、荧光光谱） (4) 旋光色散法(optical rotatorydispersion,ORD) (5) 园二色性（circular dichroism,CD） (6) 氢同位素交换法,蛋白质的二级结构,蛋白质的二级结构是指肽链的主链在空间的排列、或规则的几何走向、旋转及折叠。 只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键。 主要有-螺旋、-折叠、-转角。,肽单位,肽单位是一个刚性的平面结构 肽平面中羰基氧与亚氨基氢几乎总是处于相反的位置 C和亚氨基N 及C与羰基C 之间的键是单键，可以自由旋转,和这一对两面角决定了相邻两个酰胺平面的相对位置, 也就决定了肽链的构象。,-螺旋,Right hand

11、ed (右手旋) 每3.6氨基酸绕一圈，每圈5.4 高 肽键上C=O氧与它后面（C端）第四个残基上的N-H氢间形成氢键。 每个氢键以13 个原子夹着(13) 整个 helix 呈圆筒状，且有偶极性 氨基酸残基侧链向外 氢键的取向几乎与中心轴平行。 -螺旋在许多蛋白中存在，如-角蛋白、血红蛋白、肌红蛋白等，主要由-螺旋结构组成。,-螺旋,多肽主链按右手或左手方向盘绕，形成右手螺旋或左手螺旋。 左手螺旋与右手螺旋不是对映体。 天然蛋白质绝大部分是右手螺旋，到目前为止仅在嗜热菌蛋白酶中发现了一段左手螺旋(不稳定)；存在尺寸不同的螺旋。,折叠,由两条或多条几乎完全伸展的肽链平行排列，通过链间的氢键交联

12、而形成的。 主链构象：呈锯齿桩折叠构象 -碳原子总是处于折叠的角上，氨基酸的R基团处于折叠的棱角上并与棱角垂直，两个氨基酸之间的轴心距为0.35nm； 氢键：主要是由两条肽链之间形成；在同一肽链的不同部分之间也可以形成。,几乎所有肽键都参与链内氢键的交联 氢键与链的长轴接近垂直。,折叠,平行式 所有肽链的N-端都在同一边,反平行式 相邻两条肽链的方向相反。,-转角结构,转角部分由四个AA残基组成 弯曲处第一个AA残基的 -C=O 和第四个残基的 N-H 之间形成氢键，形成不稳定的环状结构 -转角经常出现在连接反平行-折叠片的端头。 主要存在于球状蛋白,蛋白质的三级结构,在二级结构基础上，肽链在

13、空间进一步盘绕、折叠形成特定的构象，包括主链和侧链构象，三级结构的形成使肽链中所有的原子都达到空间上的重新排布，是有特定构形的活性分子。 氢键 Hydrogen bond 离子键 Ionic interaction 疏水键 Hydrophobic interaction 二硫键 Disulfide bond 范德华力 Van derWaals interaction,蛋白质的三级结构,（1）具备三级结构的蛋白质一般都是球蛋白，都有近似球状或椭球状的外形，而且整个分子排列紧密，内部有时只能容纳几个水分子。 （2）大多数疏水性氨基酸侧链都埋藏在分子内部，它们相互作用形成一个致密的疏水核，这对稳定蛋

14、白质的构象有十分重要的作用，而且这些疏水区域常常是蛋白质分子的功能部位或活性中心。 （3）大多数亲水性氨基酸侧链都分布在分子的表面，它们与水接触并强烈水化，形成亲水的分子外壳，从而使球蛋白分子可溶于水。,肌红蛋白的三级结构,蛋白质的四级结构,蛋白质的四级结构(Quaternary Structure)是指由多条各自具有一、二、三级结构的肽链通过非共价键连接起来的结构形式；各个亚基在这些蛋白质中的空间排列方式及亚基之间的相互作用关系。 这种蛋白质分子中，最小的单位通常称为亚基或亚单位Subunit，它一般由一条肽链构成，无生理活性； 维持亚基之间的化学键主要是疏水力。 由多个亚基聚集而成的蛋白质

15、常常称为寡聚蛋白,蛋白质四级结构的作用,活性调节作用： hemoglobin（血红蛋白） 可调节酶催化活性的开启和关闭 酶的复合体：pyruvate dehydrogenase（丙酮酸脱氢酶） 聚集数种酶在一起可提高催化效率 构成结构组织：action,myosin（阻凝蛋白） 构成生物体最基本的结构物质和功能物质,几种重要的蛋白质,纤维状蛋白 角蛋白： - 角蛋白皮肤以及皮肤的衍生物 如：毛发、鳞、羽、甲、蹄、爪 丝蛋白（丝心蛋白） ： -角蛋白，反平行折叠, 如：蚕丝、蜘蛛丝 球状蛋白 血红蛋白：2条- 链，2条- 链呼吸蛋白 免疫球蛋白：抗体,角蛋白Keratin,角蛋白广泛存在于动物的

16、皮肤及皮肤的衍生物，如毛发、甲、角、鳞和羽等，属于结构蛋白。角蛋白中主要的是-角蛋白。 -角蛋白主要由-螺旋构象的多肽链组成。一般是由三条右手-螺旋肽链形成一个原纤维，原纤维的肽链之间有二硫键交联以维持其稳定性 -角蛋白的伸缩性能很好，当-角蛋白被过度-拉伸时，则氢键被破坏而不能复原。此时-角蛋白转变成-折叠结构，称为-角蛋白。,毛发的结构,一根毛发周围是一层鳞状细胞(scaIecell)，中间为皮层细胞(cortical celI)。皮层细胞横截面直径约为20m。在这些细胞中，大纤维沿轴向排列。所以一根毛发具有高度有序的结构。 毛发性能就决定于螺旋结构以及这样的组织方式。,卷发(烫发)的生物

17、化学基础,永久性卷发(烫发)是一项生物化学工程(biochemical engineering),角蛋白在湿热条件下可以伸展转变为构象，但在冷却干燥时又可自发地恢复原状。 这是因为角蛋白的侧链R基一般都比较大，不适于处在构象状态，此外角蛋白中的螺旋多肽链间有着很多的二硫键交联，这些交联键也是当外力解除后使肽链恢复原状(螺旋构象)的重要力量。这就是卷发行业的生化基础。,-角蛋白,丝心蛋白(fibroin)这是蚕丝和蜘蛛丝的一种蛋白质。丝心蛋白具有抗张强度高，质地柔软的特性，但不能拉伸。它具有0.7nm周期，这与角蛋白在湿热中伸展后形成的角蛋白很相似(0.65nm周期)。丝心蛋白是典型的反平行式公

18、折叠片，多肽链取锯齿状折叠构象，酰胺基的取向使相邻的C为侧链腾出空间，从而避免了任何空间位阻。在这种结构中，侧链交替地分布在折叠片的两侧。,丝蛋白的结构,丝蛋白是由伸展的肽链沿纤维轴平行排列成反向-折叠结构。分子中不含-螺旋。丝蛋白的肽链通常是由多个六肽单元重复而成。这六肽的氨基酸顺序为： -（Gly-Ser-Gly-Ala-Gly-Ala）n-,球状蛋白,球状蛋白是结构最复杂，功能最多的一类蛋白质。这类蛋白结构紧密，分子的外层多为亲水性残基，能够发生水化；内部主要为疏水性氨基酸残基。因此，许多球蛋白分子的表面是亲水性的，而内部则是疏水性的。典型的球蛋白是血红蛋白。 血红蛋白是一种结合蛋白。血

19、红蛋白含有四条肽链，每一条肽链各与一个血红素相连接。血红素同肽链的连接是血红素的Fe原子以配价键与肽链分子中的组氨酸咪唑基的氮原子相连。,血红蛋白,血红蛋白是脊椎动物红细胞主要组成部分，它的主要功能是运输氧和二氧化碳。 血红蛋白中，血红素Fe原子的第六配价键可以与不同的分子结合：无氧存在时，与水结合，生成去氧血红蛋白(Hb)；有氧存在时，能够与氧结合形成氧合血红蛋白(HbO2)。 血红蛋白与氧的结合不牢固，容易离解。HbO2的形成和离解受氧的分压和pH等因素的影响，氧的分压和pH较高时，有利于血红蛋白与氧的结合，反之，则有利于离解。,血红蛋白,煤气中毒的机制 一氧化碳（CO）也能与血红素Fe原

20、子结合。由于CO与血红蛋白结合的能力是O2的200倍，,免疫球蛋白,免疫球蛋白是一类血浆糖蛋白(serum glycoprotein)。糖蛋白中的蛋白质与糖是共价联接的。 免疫球蛋白是被脊椎动物作为抗体合成的。它的合成场所是网状内皮系统的细胞。这些细胞分布在脾、肝和淋巴节等组织中。 当一类外来的被称为抗原的物质，如多糖、核酸和蛋白质等侵入机体时即引起抗体的产生，这就是所谓免疫反应。抗体就是免疫球蛋白。,免疫球蛋白的结构,免疫球蛋白G,人的免疫球蛋白可分为五大类，其分子量范围从150000到950000道尔顿。免疫球蛋白M(IgM)是对一个抗原作出反应时产生的第一个抗体。 免疫球蛋白G(IgG)

21、是一类最简单的免疫球蛋白。IgG含有两条相同的高分子量的重链(heavy chain)和两条相同的低分子量的轻链(light chain)。 四条链通过二硫键共价联接成Y字形结构。每一免疫球蛋白分子含有二个抗原结合部位，它们位于Y形结构的二个顶点。,抗体的特点,抗体具有两个最显著的特点，一是高度特异性，二是多样性。 高度特异性就是一种抗体一般只能与引起它产生的相应抗原发生反应。抗原抗体复合物往往是不溶的，因此常从溶液中沉淀出来，此即“沉淀反应”。在体外，沉淀反应已被广泛用于研究抗原抗体反应，并成为免疫学的基础。多样性就是它们可以和成千上万的各种抗原(天然的和人工的)起反应。 般说来，一个抗原与

22、接受该抗原的动物关系愈远，则产生抗体所需的时间愈短，抗体反应也愈强。,抗原,某些低分子量的物质可以与抗体结合，但它们本身不能刺激抗体的产生。如果它们与大分子紧密结合，则能刺激抗体的产生。这些小分子物质称为半抗原(hapten)。 几乎所有外来的蛋白质都是抗原，并且每种蛋白质都能诱导特异抗体的产生。一个人的体内在任一个给定时刻大约有10000种抗体存在。,3.6 多肽的化学合成,多肽的合成历史： 第一兴盛时期： 1907年Fischer 合成18肽Leu-(Gly)3-Leu-(Gly)3-Leu-(Gly)9 第二兴盛时期： 1932年Bergmann 开发了氨基的保护基 第三兴盛时期： 1950年左右合成天然生理活性多肽 以上合成采用的是液相合成法 1963年：Merrifield 开发了固相合成法,合成(Leu-Ala-Gly-Val)。,多肽的化学合成,氨基酸两个功能性基因(氨基与羧基)，在合成特定的肽键时就存在一问题，要