单克隆抗体与基因工程抗体的制备.ppt

1、，第四章单克隆抗体和基因工程抗体的制备，第一节杂交技术的基本原理1，杂交技术2，两性杂交细胞的克隆培养和冷冻保存，第二节单克隆抗体的制备1，单克隆抗体生产2，单克隆抗体的性质鉴定4，单克隆抗体的特性，第三节基因工程抗体准备1，人员化抗体2 第4节单克隆抗体的应用1、检验医学诊断试剂2、蛋白质的纯化3、小分子抗体的应用4、抗体融合蛋白的应用5、双特异性抗体的应用6、抗体第1节杂交瘤技术的基本原理、杂交技术原理：聚乙二醇(PEG):细胞融合剂、免疫大鼠脾细胞与大鼠骨髓瘤细胞融合抗体类型：第一代抗体多克隆抗体第二代抗体单克隆抗体第三代抗体基因工程抗体，B淋巴细胞3 TK(英语)，淋巴细胞发育，浆细胞

2、，抗原接种，培养液：RPM1640培养液DMEM培养液，(3)细胞融合，细胞融合剂：骨髓瘤细胞培养：在大生长期选择细胞，世代培养的细胞形态：熏蒸，照射，均匀，整齐排列，避免细胞回归祖先。定期以8-AG处理细胞注意事项。不要过多代培养。细胞可以分成-80或者液氮和干冰来保存。免疫脾脏细胞的制备：1100，饲养细胞，骨髓瘤细胞，淋巴细胞(133603)50% PEG 1min 2min的10ml培养液，融合方法，SP2/0细胞融合后7天，HT培养液，细胞融合，1020天克隆HAT选择性克隆，融合细胞早期培养，HGPRT酶和TK酶叶酸拮抗剂，阻止DNA合成的主要途径T(Thymidine):使胸腺核

3、细胞通过替代途径合成DNA的“核苷酸”DNA合成的主要途径是A阻断骨髓瘤细胞。不能生长，死了57天。HGPRT不足，DNA合成的替代路径阻塞，SP2/O: HGPRT-，TK-；长寿脾细胞： HGPRT，TK；短命(7天)杂交瘤细胞：HGPRT，TK；长寿、骨髓瘤细胞、脾细胞、杂交瘤细胞、杂交瘤细胞有限稀释法微处理法(FACS法) “30-70液氮”快速融化多次遗传容易丢失染色体，因此细胞产生抗体的能力逐渐减弱或消失，应尽快使用获得的抗体良性杂交瘤细胞株，准备单克隆抗体。1，生产单克隆抗体，动物体内诱导法：每次BALB/c或F1代大鼠，(510)105/体外培养法：中空纤维培养系统单抗含量不高

4、，牛血清Ab难以去除，腹腔注射法，5天前腹腔注射水溶性抗原：ell免疫荧光法、盐析亲和层析离子交换层、McAb的纯化、Ig类型、亚流测定：双扩张法或ELISA法特异性测定：抗原类似物的交叉反应逆价格测定：用腹水或培养液的稀释度测定：用抑制素测定：几株单株是否为不同的表观特异性、竞争法测定加成指数法及微电脑聚类分析亲和性4高度特异性高的均匀度和重复性弱的凝集反应和沉淀反应对环境不敏感的特性；(1)单克隆抗体的特性；优点：在体外“永久”存活，继承相对不纯的抗原，得到很多高度特异性和均匀的抗体。标记抗体为特征的免疫学分析方法可以用于体内的放射免疫图像和免疫诱导治疗，(2)单克隆抗体的优点和局限性，限

5、制：固有亲和力和有限的生物活性限制了其应用范围反应强度比多克隆抗体制备技术复杂，耗时和价格高。(威廉莎士比亚，Northern Exposure(美国电视电视剧)，McAb PcAb抗原要求可能纯度高，特异性高，稳定，沉淀反应低，McAb和PcAb比较，McAb和PcAb，我主要包括嵌合抗体、单链抗体、人性化抗体、双价抗体、双特异性抗体。消灭老鼠Ig基因，感染人类Ig基因，在老鼠体内生成人类Ab，并通过杂交瘤技术生成大量完整的人性化抗体，1，人性化抗体，方法：从杂交瘤细胞中分离功能性可变区域基因，与人类Ig常量区域基因连接，插入适当的表达体，宿主细胞传递，表达人-重组同时具备小鼠原性单倍体特异

6、性和抗体亲和力的人员化抗体。RAb也称为“改造型抗体”，主要与CDR的“移植”有关，因此“CDR移植抗体意义：各种不同寻常的老鼠原抗可应用于临床治疗，(2)改造抗体，(2)Fab:抗原结合片段Fv:可变区域片段ScFv:肿瘤抗原，4，双特异性抗体，分别分离徐璐其他两个茄子McAb，将每个抗体分解为单价抗体，然后将两个茄子其他抗原特异性的单价抗体通过化学试剂交叉，再分离目的组。牙齿方法的缺点是抗体容易失去活性，产物的均匀度不好。化学交叉BsAb将徐璐分泌其他特异性单项式的两个茄子杂交瘤细胞重新融合，形成4元杂交瘤(quadroma)。但是，二次杂交细胞株分泌的是两组中链，斜链的任意组合物。BsA

7、b的百分比可以是10P%。多倍杂交瘤细胞稳定性差，BsAb产量低，活性低，耗时，应用林爽时有抗鼠抗体免疫反应(HAMA)牙齿，不适用于临床。使用大量抗体分子片段(例如细胞工程BsAb、Fab、Fv或ScFv)，通过基因操作修改，在体外组装为BsAb，或直接表达分泌型BsAb。基因工程学科BsAb，定义：在体外将克隆的抗体基因片段插入噬菌体载体，传染给工程细菌进行表达，然后选择抗原，就能获得特殊的单克隆抗体。利用牙齿技术可以获得完全的人员性抗体，对HIV等病毒感染和肿瘤的诊断和治疗具有独特的优越性。5、噬菌体抗体库技术，将PCR扩增的抗体重链作用域(VH)和轻链作用域(VL)基因复制到噬菌体载体

8、上，表达外壳表面抗原抗体反应所需抗体的克隆和扩增。以分泌抗体基因的方式表达，获得可溶性抗体片。抗体库：组合抗体库：在数据库构建过程中，随机组合VH和VL的天然抗体库：抗体mRNA是未免疫的正常人，(1)从基本原理和程序、噬菌体抗体库、外周血或脾脏、淋巴结等分离B淋巴细胞，提取mRNA，提取cDNA以逆转。应用抗体轻链和重链讲义，根据数据库构建的需要，通过PCR技术放大各种Ig基因片段。构造噬菌体向量。噬菌体抗体库向量有三种：噬菌体、丝状噬菌体和吞噬颗粒，其中两种是目前构建表面表达的噬菌体抗体库中常用的向量。表达载体改造细菌，构建整套抗体库。通过多轮抗原亲合吸附-溶出-扩增，最终筛选了抗原特异性

9、抗体复制。可以模拟自然范围的抗体库抗体库，以达到或超过1011库的容量。可以包含b细胞整个克隆库的外源基因来自人体多克隆细胞的总mRNA共同引诱物的人的物种普遍性抗体的VH和VL基因的随机重组也增加了抗体的多样性。(2)噬菌体抗体库技术的特点，避免人工免疫和杂交技术抗体库高容量抗体库的高选择性效率，获得亲和力的人员化抗体VH和VL基因的随机重组，模拟体内抗体亲和力成熟过程中使用的抗体基因来自人体，4节单克隆抗体的应用。(威廉莎士比亚，Northern Exposure(美国电视电视剧)，检查医学诊断试剂蛋白的纯化小分子抗体的应用抗体融合蛋白的应用双特异性抗体的应用抗体库技术的应用及展望，医院微

10、生物抗原，抗体的检测肿瘤抗原的检测免疫细胞及其子群体的检测激素测定细胞因子的测定，1，检查医学诊断试剂，病菌药物测定(TDM):抗排斥剂抗肿瘤药物地高辛单克隆抗体吸附在惰性固相基质(如Speharose 2B、4B、6B等)上，以分层柱准备。 样品通过层分析柱时，要分离的抗原可以结合固相单克隆抗体和特异性，其余成分不能和它结合。充分冲洗分层分析柱后，改变洗脱液的离子强度或pH值，分解要分离的抗原和抗体，收集洗脱液就能得到要纯化的抗原。，MACS，定义：分子量小，但具有抗原结合功能的分子段的优点：分子量小，渗透性强，抗原性低，不含Fc段，不与具有Fc段受体的细胞结合。不良反应少，原核系统表达和基

11、因工程操作半衰期短，有助于及时中和和消除毒素，3，有助于小分子抗体的应用。应用：用于肿瘤诱导治疗的影像分布基因治疗细胞内抗体。通过在细胞内表达特异性来识别特定的基因产物，会阻碍基因结构和功能的关系，肿瘤体内的影像具有单链抗体去除速度快，穿透力强，肿瘤组织的分布指数比完整的抗体分子高放射影像快，放射性核素去除速度快，对身体的危险度小。影像基础低的理想影像包括诊断向量病毒的诊断和抗病毒感染血液病的诊断白血病的免疫诊断和分类，4，抗体融合蛋白的应用，在体外免疫检查中应用自体红细胞凝集实验，快速检测HBV和HIV病菌等，避免化学融合，减少两者的活性，提高酶免疫检查的灵敏度。使用双特异性抗体作为双抗。检测限度1ng/ml，5，双特异性抗体的应用，用于诊断体内肿瘤放射免疫成像的方法：双特异性抗体的一只手臂与靶抗原结合，一只手臂与