9 多酚氧化酶,过氧化物酶,脂肪氧合酶.ppt

1、9 其他氧化还原酶多酚氧化酶过氧化物酶脂肪氧合酶,暨南大学食品科学与工程系 包惠燕,食品酶学-包惠燕-9,本章重点,多酚氧化酶催化的反应及酶促褐变的防止. 过氧化物酶催化的反应及特性. 脂肪氧合酶催化的反应及意义.,思考题,试述酶促褐变的原理及防止酶促褐变的方法。 过氧化物酶的热失活有什么特点？ 脂肪氧合酶作用的底物是什么，此酶催化的反应对食品质量有何影响？,9.1 多酚氧化酶(Polyphenol oxidases, PPO, EC1.10.3.1),多酚氧化酶(邻二酚:氧 氧化还原酶)广泛存在于各种植物中，是一种含铜的酶。 在新鲜、冷冻、干制和罐藏产品，多酚氧化酶引起的褐变会严重损害食品的

2、感官质量，因此它对于果蔬加工和保藏具有重要意义。,9.1.1多酚氧化酶的名称和在自然界的分布,一、 酶的名称 早期的文献中习惯名称“多酚氧化酶”指的是两种不同的酶: 一种能作用于羟基处在邻位的二酚和三酚化合物,也能作用于单酚,将其转变成邻二酚. 另一种能氧化邻-和对-二酚.它常被称为虫漆酶(laccase)主要存在于日本的虫胶树),它不能使单酚羟基化. 我们讨论第一种酶，PPO这个缩写指的就是第一种,二、多酚氧化酶在自然界的分布,含量随品种不同，橄榄中活力最高. 分布取决于品种和年龄及成熟度. 在果蔬的不同部分的含量差别很大. 分结合的(bound)和可溶性(soluble)的两类，其比例随果

3、蔬的成熟度而变. 品种可溶态的PPO占总酶活力的百分数 桃 20%30% 甜樱桃 15%17% 杏子 13% 苹果 8%15%,9.1.2 PPO催化的反应及其作用的底物,一、PPO催化的反应 PPO能催化两类完全不同的反应： 1）一元酚羟基化，生成相应的邻-二羟基化合物。 2）邻-二酚氧化，生成邻-醌。 两类反应都要分子氧的参与。,PPO催化的反应,单酚单加氧酶Monophenol monooxygenaseEC1.14.18.1,儿茶酚氧化酶EC1.10.3.1,推荐名: Catechol oxidase 系统名: 1,2-benzenediol: oxygen oxidoreductas

4、e 异名: * Catecholase * diphenol oxidase * dopa oxidase * o-diphenol oxidoreductase *o-diphenolase *phenolase *polyphenol oxidase * pyrocatechol oxidase *tyrosinase,漆酶（Laccase）EC1.10.3.2,推荐名: laccase 系统名: benzenediol（二酚）: oxygen oxidoreductase 异名: * benzenediol: oxygen oxidoreductase *diphenol oxidase

5、 *p-diphenol oxidase *ligininolytic oxidase *urushiol（漆酚） oxidase,酶促褐变的原理,酶促褐变是PPO催化的氧化反应的最初产物邻-醌继续变化的结果： 1）相互作用生成高分子量聚合物； 2）与氨基酸或蛋白质作用生成高分子络合物； 这两个非酶反应导致褐色素的生成；色素的分子量愈高，颜色愈暗。 此外邻醌也可 3）氧化那些氧化-还原电位较低的化合物，形成无色的产物。,黑色素的形成Formation of melanins from tyrosine,二、PPO的底物,PPO作用机制,果蔬中普遍存在的酚类化合物,果蔬中普遍存在的酚类化合物(续

6、),果蔬中普遍存在的酚类化合物(续),香蕉果皮中的酚类物质,荔枝、龙眼果皮的酚类物质,9.1.3 pH和温度对PPO活力的影响 一、pH对酶活力的影响,pH对PPO活力的影响,1. 多数情况下，最适pH在47之间。 2. 从不同种类，不同品种植物的PPO具有不同的最适pH. 3. 果蔬不同部位的PPO的最适pH也有差异。 4. 酶的提取或分离方法对最适pH也有影响 5. 测定酶活力时所采取的底物和缓冲液对酶的最适pH也有影响。 6. 大多数PPO具有一个最适pH，在一些情况下具有第二个最适pH.,二、温度对PPO活力的影响,影响PPO最适温度的因素类似于最适pH的情况。 大多数情况下，在组织或

7、溶液中的酶用7090短时间处理，已足以使其部分或全部不可逆失活。 PPO的热稳定性与它的来源有关。 低温下表现为可逆失活。 由于冷冻引起的细胞破裂，使酶与它的内源底物接触而导致果蔬很快褐变，所以冷冻前需要用热处理的方法使PPO失活。,9.1.4 PPO的激活剂、抑制剂和果蔬酶促褐变的防止,一、激活剂 （尚未有系统的研究结果报道。） 推测PPO激活过程中酶蛋白经历了缔合或解离的变化。PPO的活性形式是含酮的酶单体的寡聚体。激活剂的作用是使酶蛋白以一定的聚合度存在，从而具有生物活性。 一些激活剂：SDS，酸或脲素，Cu2+，3，4-二羟基苯丙氨酸 它们分别对一些来源的PPO有激活作用,二、PPO的

8、抑制剂和酶促褐变的防止 1.酶的热失活,从理论上讲，果蔬酶褐变的防止可以采用钝化酶、去除一个底或几个底物（氧或多酚类物质）、添加PPO抑制剂或黑色素形成抑制剂等方法。 1.酶的热失活 此法可能会产生不好的颜色或风味、质构的变化。,2. 消除酶反应的一个底物,多酚物质可以用-环糊精或聚乙烯聚吡咯烷酮（poly (vinyl polypyrrolidone), PVPP）,聚乙烯吡咯烷酮（poly(vinyl pyrrolidone),PVP), 聚乙二醇(poly(ethylene glycol),PEG)等除去。 气调贮藏时用氮气或二氧化碳取代空气中高浓度的氧气，可以减缓或防止酶促褐变。,3.

9、PPO抑制剂,许多金属螯合剂如氰化物，一氧化碳，铜锌灵，2-巯基苯并噻唑，二巯基丙醇或叠氮化合物对PPO都有抑制作用，其中有些还能与酶反应生成的醌作用。 在这类抑制剂中，对食品加工和保藏有实际价值的是抗坏血酸，柠檬酸，亚硫酸盐，巯基化合物。 4-己基间苯二酚是近年来发现并已被验证对酶促褐变（如马铃薯，苹果，莴苣）具有较好抑制作用的新型抑制剂。,4.其他,酸性pH条件 蛋白酶（木瓜蛋白酶，无花果蛋白酶，菠萝蛋白酶）处理，使PPO被破坏。 使用还原性化合物是目前最有效的防止酶促褐变的方法。,请阅读1：,酶促褐变的抑制方法,从理论上讲,果蔬的多酚氧化酶引起的酶促褐变可以通过加热钝化酶、去除一个或几个

10、底物(O2和多酚类物质)、降低pH、添加PPO抑制剂或黑色素形成的抑制剂等方法来加以控制。目前已知的PPO抑制剂有很多种, 但真正有潜力能替代亚硫酸盐的不多。 天然方法: 如利用色拉酱的几种成分进行互相抑制.如菠萝汁对苹果切片的酶促褐变有很好的抑制作用;蜂蜜中分子量大于600的某些多肽对白葡萄及一些水果切片的PPO酶有很好的抑制作用.,化学方法抗坏血酸,它对酶促褐变有较好的抑制作用,主要是由于其能把醌还原成酚类化合物,从而阻止了黑色素的形成.但如果抗坏血酸被氧化成脱氢抗坏血酸(DHAA),则醌类物质同样可以积累而形成黑色素. 如用热抗坏血酸/柠檬酸溶液处理去皮土豆,其货架期可延长至2周. 过高

11、浓度的抗坏血酸(0.75%)会使水果有一种不愉快的风味. 抗坏血酸的衍生物,如异抗坏血酸、磷酸抗坏血酸、三磷酸抗坏血等也对褐变有很好的抑制作用.,化学方法 柠檬酸和EDTA,柠檬酸作为一种酸化剂和螯和剂也对PPO酶有很好的抑制作用 若它能与抗坏血酸或其衍生物联合处理(如1%柠檬酸+0.25%抗坏血酸)对切分土豆、苹果等有更佳的抑制褐变作用 乙二胺四乙酸(EDTA)作为一种螯和剂,与其它褐变抑制剂一起处理,对切分果蔬也有很好的抑制褐变的效果.,化学方法 -已基间苯二酚,4-已基间苯二酚(4-HR)是近年来发现的并且已经被实验证实对酶促褐变(如苹果、土豆、莴苣)有较好抑制作用的新型抑制剂. 4-H

12、R能与PPO酶结合而使PPO酶失去催化活性,它的特点是在非常低的浓度下(0.005%)便能起作用,况且它化学稳定性相当好,对褐变前存在的其它色素又没有漂白作用,因此它是一种很有潜力的酶促褐变抑制剂,在美国已经作为商品EverFresh的主要活性成分用来抑制酶促褐变,化学方法 含硫氨基酸,含巯基氨基酸如半胱氨酸通过与醌类物质反应形成无色稳定化合物也能阻止黑色素的形成,用在土豆、苹果、莴苣等切分果蔬的褐变抑制上. 它也成为一些防褐变的商业产品的主要活性成分之一.若能与柠檬酸联合(如0.5%L2cys+2%柠檬酸)则效果更佳,酶法蛋白酶,有人发现蛋白酶对土豆和苹果切片的褐变有较好的抑制作用. 这可能

13、是由于蛋白酶使催化酶促褐变的酶水解所致.分解蛋白质的酶有很多,其中主要有3种植物蛋白酶(无花果蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶)被证实对酶促褐变抑制很有效. 如在4时无花果蛋白酶对去皮土豆褐变的抑制与亚硫酸盐效果相当,在4 和24 时木瓜蛋白酶对切分苹果酶促褐变的抑制与亚硫酸盐同样有较好的效果.,物理方法高氧气调包装,高氧的气调包装(MAP)对抑制酶促褐变、抑制厌氧发酵、抑制好氧和厌氧细菌生长等都有较好的作用。高氧环境的MAP对酶促褐变的抑制可能是由于引诱了底物对PPO酶的抑制或者是连续形成的高浓度无色醌类化合物对PPO酶的反馈抑制的结果。 20%CO2+80%N2的包装与柠檬酸/抗坏血酸预处理

14、联合对切分土豆酶促褐变抑制效果很好,在7d后仍有较好的感官品质。 CO气体对蘑菇的PPO酶也有抑制作用,在MAP系统中使用对抑制酶促褐变有利,但由于CO具有毒性,使用时应特别注意人身安全. 此外,超过800MPa的高压对酶促褐变也有一定的抑制作用.,其他方法,可食性膜对切分果蔬的酶促褐变有很好的抑制作用.一方面,利用可食性膜对氧气的透性使果蔬表面的氧气浓度维持在较低水平,不但抑制了褐变也降低了果蔬的呼吸作用与乙烯的产生,有利于贮藏;另一方面,在成膜剂中加入抗氧化剂!抗褐变剂可以降低切分果蔬的氧化变质与变色.其中使用较多的可食性成膜剂有卡拉胶、黄原胶、改性淀粉等,若在成膜剂中加入抗坏血酸、柠檬酸

15、、EDTA等抗褐变剂则效果更为明显. 乳酸菌能产生一些低分子量的物质如酸、乙醇、CO2、过氧化氢、双乙酰等.乳酸菌产生的杀菌剂对切分果蔬的保鲜很有潜力.,9.1.5 PPO的多种分子形式,PPO的多种分子形式是一个颇为复杂的问题。产生PPO多种分子形式的部分原因和酶蛋白的缔合-解离现象有关： 1）类似的亚基不同程度的聚合 2）不同亚基不同方式 的结合 3）酶蛋白质构象的改变 4）前三种情况的结合,PPO的多种分子形式,亚基的分子量约为30000（香蕉12000,甜菜叶绿体PPO亚基10000), 含有一个铜离子。 酶的各种形式之间可以相互转变。导致相互转变的因素： 酶液 pH 离子强度或浓度

16、蛋白质解离剂的作用等,PPO的多种分子形式,PPO不同形式之间的差别表现在 底物特异性 最适pH 温度稳定性 对抑制剂量敏感性等 此外，氧化和羟基化活力之比在PPO的不同分子形式之间也有差别。,9.1.6 PPO活力测定,1）测定底物消失的速度 一般采用量压法（瓦氏呼吸仪）或极谱法（氧电极）测定氧气消失的速度 2）测定产物生成的速度 采用分光光度法,参考文献阅读2：付聿成，王妮娅，杜金华金帅苹果多酚氧化酶提取及部分酶学特性研究，食品工业科技，2006, 27(2): 59-62金帅苹果PPO提取及酶学特性.kdh,PPO提取及酶活测定 提取 将已预冷的苹果样品破碎，加入已预冷的磷酸氢二钠+柠檬

17、酸缓冲液 （含适量的 PVPP和 TritonX 100），在果蔬破碎机中以 1min为间隔打浆3 min，然后4000转/分离心 10 min，取上清液0提取30 min后再在4 离心30 min ，得到上清液即为 PPO粗酶液。,参考文献阅读3,苹果中PPO的提取,PPO活性测定1,pH对苹果PPO活性的影响,温度对苹果PPO活性的影响,咖啡酸对4-甲基儿茶酚PPO酶促反应的影响,VC,CYS,焦亚硫酸钾(K2S2O5)等对PPO的抑制,苯甲酸系列对PPO的抑制,肉桂酸系列对PPO的抑制,参考文献4. 食品工业科技2002.4,马铃薯PPO的提取,PPO活性测定2,马铃薯PPO的热稳定性,

18、温度对马铃薯PPO活性的影响,pH对马铃薯PPO活性的影响,底物浓度对PPO酶活性的影响,酶浓度与反应速度的关系,抑制剂对PPO活性的影响-1.二巯基丙醇的影响,抑制剂对PPO活性的影响-2.亚硫酸钠的影响,抑制剂对PPO活性的影响-4.抗坏血酸的影响,参考文献5,酚类底物,果实中与酶促褐变有关的酶,香蕉果肉PPO,*过氧化物酶POD与褐变,PPO、POD与褐变,酶和底物区域化分布的破坏是酶促褐变的原因,与果实组织褐变相关的因素,荔枝果皮的褐变,龙眼、梨的褐变,果实贮藏期间的褐变,9.2 过氧化物酶 （Peroxidase）,催化的反应： H2O2+AH2 2H2O+A Cf: 过氧化氢酶：A

19、H2亦为过氧化氢 过氧化物酶广泛存在于自然界，可分类如下： 含铁过氧化物酶 正铁血红素过氧化物酶 绿过氧化物酶 黄蛋白过氧化物酶,9.2.1 过氧化物酶在自然界的分布,在植物细胞中以两种形式存在： 1）以可溶形式存在于细胞浆中 2）以结合形式在细胞中与细胞壁、膜或细胞器相结合而存在 一些化合物能诱导过氧化物酶的产生：赤霉素，苯基硼酸，乙烯,9.2.2 过氧化物酶在食品加工中的作用,过氧化物酶在植物生命循环中可能的作用： 过氧化物酶和木质素的生物合成有关； 过氧化物酶通过氧化吲哚乙酸参与植物生长调节； 过氧化物酶是果蔬成熟和衰老的指标； 过氧化物酶可能与果蔬成熟时叶绿素的降解有关； 一些果蔬中使

20、胡萝卜素褪色的酶具有过氧化物酶的特征。,过氧化物酶在果蔬加工和保藏中的主要的作用,1）此酶活力与果蔬产品（特别是那些非酸性蔬菜，）在保藏期间形成的不良风味有关 2）此酶属于最耐热的酶类，它在果蔬加工中常被用作热处理是否充分的指标。,9.2.3 过氧化物酶催化的反应,能催化四类反应： 1）有氢供体存在的条件下催化过氧化氢或氢过氧化物的分解，即过氧化活力 2）氧化作用 3）在没有其他氢供体存在的条件下催化过氧化氢的分解 4）羟基化作用,9.2.4 过氧化物酶的最适pH和最适温度,过氧化物酶的最适温度,不同来源的过氧化物酶在最适作用温度上存在很大的差别.如马铃薯和花菜的过氧化物酶的最适温度分别为55

21、 和3540 ,9.2.5 过氧化物酶的稳定性 过氧化物酶的热失活特性,许多果蔬中的过氧化物酶的热失活是一个双相和部分可逆的过程. 热失活的双相过程指的是过氧化物酶中含有不同的耐热性质部分.其中不耐热部分在热处理时很快失活,而耐热部分在同样温度下缓慢失活.,过氧化物酶失活的部分可逆过程,热失活的部分可逆过程指的是经热处理后的酶液在室温或较低温度下保藏时，它的部分活性可以再生。,乳过氧化酶系统用于牛奶保存The Lactoperoxidase System (LP-s) of Milk Preservation,不同温度下灭活牛奶中的酶和微生物所需时间-磷酸酶是牛奶热处理是否充分的指标,简化的在

22、线过氧化物酶活力检测方法,过氧化物酶试验 a) 溶液: 1% 愈疮木酚的醇溶液 (1 g愈疮木酚溶于50 mL 96% 乙醇再用乙醇定容至100mL); 0.3% 过氧化氢溶液(1 mL 双氧水用蒸馏水定容至100 mL.,简化的在线过氧化物酶活力检测方法(续),b) 取样. 从材料的不同部分取样（约20-30片）碾碎得到均一的样品。 c) 检测. 从样品中取10-20 g于中试管; 向其中倒入: 20 mL 蒸馏水; 1 mL 1% 愈疮木酚溶液; 1.6 mL of 过氧化氢溶液.,简化的在线过氧化物酶活力检测方法(续),把试管内容物摇匀。 结果判断： 微阳性-有淡粉色渐渐出现，表明过氧化

23、物酶的钝化不彻底。 阴性-五分钟后没有组织颜色的改变，表明过氧化物酶已经被钝化.,简化的在线过氧化物酶活力检测方法(续),作为定性试验，检测可以更进一步简化：直接滴几滴1% 愈疮木酚溶液和0.3%过氧化氢溶液于烫过并碾碎的蔬菜中. 快而强烈的组织呈色反应-棕红色表明有过氧化物酶活力高（阳性反应）。,过氧化化氢酶试验（Catalase test）,将2 g脱水蔬菜 压碎，与20 mL 蒸馏水混合，向其中加入0.5 mL 0.5%或1%过氧化氢溶液， 如果存在过氧化氢酶活力，可观察到2-3 min的强烈的氧气生成反应。,简化的在线过氧化物酶活力检测,这些实验对检验蔬菜的热烫处理（时间和温度）极为重

24、要 酶的钝化不完全对终产品有消极影响。,简化的在线过氧化物酶活力检测,对卷心菜（cabbage）过氧化氢酶钝化就已经足够， 进一步热烫至过氧化物酶失活会对产品质量产生消极的影响，甚至完全褐变。 对其它蔬菜和土豆，两种试验-过氧化物酶试验和过氧化氢酶试验，都应该为阴性,阅读: 罗曼，邹国林，邬开朗等.笋壳过氧化物酶提纯及综合利用研究.氨基酸和生物资源(J)，2000,22(4):28-32,9.2.6 过氧化物酶的应用-酚类污染的处理,酚类可被辣根过氧化物酶（HRP）清除。 酚类可被氧化为含苯氧基的自由基，后者可进一步反应生成不同的聚合物或低聚物，它们的毒性低于酚类，而且这些产物因为溶解度低，很

25、容易从水中移去。 HRP, H2O2, 和酚作用2h, 可以得到五种稳定的二聚物和一种稳定的三聚物。,9.3 脂肪氧合酶（Lipoxygenase, LOX, EC1.13.11.12),9.3.1 脂肪氧合酶催化的反应 脂肪氧合酶（亚油酸：氧 氧化还原酶；EC1.13.1.13） 催化含顺，顺-1，4-戊二烯的不饱和脂肪酸的氢过氧化作用。生成的氢过氧化物具有高反应活力，可以作用于不同的食品中不同的组分。 LOX1_SOYBN Main-chain trace -Chain: A ( 818 residues ) - K&S: 42 helices, 16 strands Metals 1 F

26、E ion,LOX作用于亚油酸产生亚油酸的13-L-和9-D-氢过氧化物衍生物,几种脂肪氧合酶的相对活力,9.3.2 脂肪氧合酶作用的初期产物(氢过氧化亚油酸ROOH )的进一步变化,包括： 1）ROOH的还原 2）酶催化ROOH异构化成多羟基衍生物和酮 3）ROOH的环氧化 4）ROOH在马铃薯中酶催化下生成乙烯醚 5）在无氧条件下，脂肪氧合酶催化ROOH发生二聚化反应，同时生成戊烷和氧代二烯酸等产物。 6）ROOH分解生成挥发性的醛和酮。,ROOH 的进一步变化(续),ROOH通过上述各种途径产生数以百计的不同产物，能同时产生合乎需要和不合乎需要的感官质量。 除此之外，ROOH还能与食品中

27、非脂肪成分作用，从而进一步影响食品的质量。,9.3.3 脂肪氧合酶的活力测定,1 量压法(warburg呼吸仪法，AACC方法),2 分光光度法,3 KI-淀粉法,文章阅读: 热烫处理终点的预测Predicting the end point of a blanching processRaul L. Garrote, Enrique R. Silva, Ricardo A. Bertone, Ruben D. Roa. Lebensm.-Wiss. u.-Technol. 37 (2004) 309315,9.3.4 pH对脂肪氧合酶作用的影响,对于大多数脂肪氧合酶，pH-酶活力曲线的最高点相当于pH7.08.0. 但pH低于7.0时酶活力下降的部分原因是因为亚油酸的溶解度在酸性范围内下降。 表面活性剂吐温20对大豆脂肪氧合酶的pH-酶活力曲线有影响，它使最适pH向低pH方向移动，并使酸性条件下的酶活力增加。,9.3.5 脂肪氧合酶的作用对