流式配色及分析ppt课件.ppt

1、流式配色分析及实验设计,1,荧光素是具有荧光特性的染料 只在特定波长激光照射后才发出自身荧光 发出的荧光颜色（波长）也是固定的,什么是荧光素,关于流式抗体,2,流式细胞技术： 在细胞分子水平上； 通过单克隆抗体； 对单个细胞或其他生物粒子；进行多参数； 快速的； 定量分析。,3,光学系统：经荧光染色的细胞在激光的照射下产生散射光和荧光信号，同时被前向光电二极管和一组光电倍增管（PMT）接收，荧光信号经一系列双色性反射镜和带通或长通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号,光源,液流通路,信号和数据,光源,液流通路,液流系统：鞘液包绕着单行排列的细胞依次高速通过流动池，而激光聚焦于流动池中心的样

2、本流上，随后经检测的样本和鞘液流向废液桶。,4,前向角散射光信号,5,侧向角散射光信号,6,外周全血细胞散射光双参数点图（红细胞溶解后）,7,荧光信号,使用不同荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析 荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量,8,光学系统：滤光片,如何将一束混合的荧光区分开来，分别进行收集呢？ 滤光片置于荧光探测器前，限定其接收的荧光的波长范围,Longpass(LP) Shortpass(SP) Bandpass(BP),9,10,11,12,流式结果除了染色的每个荧光抗体的表达情况，还包含了细胞的大小和复杂程度的情况 FSC：前向角散射光，值越大，细胞越大 SSC：侧向角散射

3、光，值越大，细胞越复杂,13,双参数散点图,单参数直方图,14,15,多色组合原则,强弱搭配 避免补偿 减少偶联染料 避开自发荧光,16,流式细胞术中常见的荧光抗体一览,17,常见流式仪可用荧光抗体一览,18,可以也仅可以最多选择8个荧光抗体去标记抗原； 需要注意： 同一通道不可以选2种荧光抗体，例如：AF488，BB515,FITC 不可以同时使用；,19,CD5,CD8,染料的亮度与抗原表达强度相匹配,20,三大类: Primary: 很好鉴定，容易区分阴阳性细胞群，阴阳性峰分得很开 Examples: CD3, CD4, CD45 Secondary: 很好鉴定，较高水平表达，经常连续性

4、表达 Examples: CD27, CD28, CD45RA, CD45RO Tertiary: 低水平表达，激活性marker，或者表达区分不明显 Example: CD25,染料的亮度与抗原表达强度相匹配,21,染料的亮度与抗原表达强度相匹配,强弱搭配： 即弱表达的抗原搭配强荧光，强表达的抗原搭配弱荧光,荧光素的强弱： 强4：APC, PE,PE-CY7 BV421 弱4：Fitc percpcy5.5 apc-cy7 BV510,抗原的强弱： 强的：CD3,CD4,CD8,CD45等 弱的：大部分胞内/核内因子（IL系列，Foxp3等）； CD25,大部分CD大于100（CD127,C

5、D133等）；,22,染料的亮度与抗原表达强度相匹配,23,染料的亮度与抗原表达强度相匹配,Panel1,24,染料的亮度与抗原表达强度相匹配,Panel2,25,染料的亮度与抗原表达强度相匹配,Panel1,26,染料的亮度与抗原表达强度相匹配,Panel2,27,避免补偿,CD45-FITC Dim CD4-PE,CD45 FITC 漏到 PE， CD4 PE 弱信号分不开,CD45- PerCP Dim CD4-PE,CD45 PerCP 不漏到 PE ，弱 CD4 可以分开,Uncompensated,Compensated,data spread due to spillover,2

6、8,避免补偿,1）采用多激光激发减少重叠,2）避免双激发荧光染料,488激发：fitc pe percpcy5.5 pe-cy7 635激发：apc apc-cy7 405激发：BV421 BV510,CD3/CD4/CD8 可选 fitc apc-cy7 BV510,减少Pe-cy5，Amcyan等荧光抗体的使用率；,29,0 hours,2 hours,22.5 hours,PE,CD8,CD3,PE-Cy5,PE-Cy7,样本曝光时间,PerCP,减少偶联染料的使用率：,30,选择更稳定的偶联染料：,31,自发荧光多的选择用635激发的染料,Perfect!,32,多色组合原则,1、要用

7、什么抗体？要用多少种抗体？ 最多8种 4+2+2 2、强弱搭配 染料的亮度与抗原表达相匹配 3、避免补偿 不同激光器激发/ 避免双激发染料 4、减少偶联染料 使用更稳定的偶联染料 5、自发荧光高的样本： 红激光激发,33,优宁维流式免费课堂,流式实验上机前的准备,34,CD19,CD4,CD56,CD14,CD16,CD8,CD(Cluster of Differentiation) marker: 用于鉴定白细胞的分类，不同的白细胞表面带有不同的CDmarker,35,通过带有荧光标记的抗体和抗原特异性结合：,CD19,CD4,CD56,CD14,CD16,CD8,36,流式鉴定白细胞的各种

8、亚型：,37,表面蛋白流式检测步骤：,Stain,Analyze,Wash*2,38,检测胞内细胞因子:,39,胞内因子流式检测步骤：,Fix,Permeabilize,Stain,Analyze,40,表面染色和胞内染色的区别？,CD4,IFN-r,Th1细胞,CD4,IFN-r,正常染色情况下，由于抗体无法穿过完整的细胞膜，胞内因子无法被染上颜色，仅表面marker染色成功；,41,通过固定破膜建立胞内染色通道,IFN-r,Th1细胞,表面染色,固定破膜,胞内染色,42,固定剂和破膜剂,固定剂： 起稳定细胞膜、保持细胞膜表面抗体与抗原结合的作用；,破膜剂： 使流动的、完整的细胞膜产生小孔以

9、利于抗体进入细胞； （少量沉淀正常，皂角苷沉降）,破膜的位置不同，破膜剂的选择不同：,对于核内/转录因子的检测，我们需要采用针对破核的破膜剂；,43,固定剂和破膜剂,This kit enables the fixation and permeabilization of cells which is necessary for staining intracellular cytokines with fluorochrome-conjugated anti-cytokine antibodies.,The BD Pharmingen Transcription Factor Buffer

10、Set is optimized for fixing and permeabilizing cells prior to immunofluorescent staining and flow cytometric analysis of cells that express specific intracytoplasmic and intranuclear proteins.,44,胞内因子和核内因子的同时检测：,问：同时检测Th1/Th2/Th17和Treg这几个细胞时是否有推荐的 buffer？,答：核内因子和胞内因子共测时一般推荐使用BD:562574转录/核内因子固定破膜试剂盒；

11、 但是： 经验证，FoxP3 与 IL-4无法同时检测 ，但 FoxP3和IL-17a、 IFN-一起染色良好。 故当需要同时检测th2/Treg时需要准备2种固定破膜试剂盒并分开检测。,45,胞内因子的含量与检测效果,为何同时检测Treg和Th，Th的阳性率很低而Treg正常？,46,胞内因子的含量与检测效果,为何同时检测Treg和Th，Th的阳性率很低而Treg正常？,仅活化状态下的T细胞才会特异性的分泌相关分泌型细胞因子，而正常情况下大部分T细胞处于未活化状态； Foxp3本身属于转录因子，始终存在于Treg细胞之中；,如想要鉴定到th中的细胞因子，则必须对其进行“开源”与“节流”。,4

12、7,胞内因子的含量与检测效果,如想要鉴定到th中的细胞因子，则必须对其进行“开源”与“节流”。,开源：刺激活化T细胞。方法有二： 1:PMA（PHA/LPS.)Ionomycin: PMA能自由透过细胞膜，因此能绕过细胞膜受体直接激活PKC; Ionomycin则能使细胞膜外Ca2+进入膜内增加，导致细胞内游离钙浓度升高； 只有PMA+Ionomycin联合应用才是使T细胞进入细胞周期的最有效的方法. 2.CD3/CD28： 通过包被CD3和添加游离的CD28来封闭抗原提呈，从而一定程度上可以促进T细胞增殖；但是效果不如PMA+离子霉素，并且对于某些T细胞亚型的活化效果也不好；,48,胞内因子

13、的含量与检测效果,如想要鉴定到th中的细胞因子，则必须对其进行“开源”与“节流”。,节流：阻断细胞内的蛋白转运： 1:Monensin： 莫能霉素是一种离子载体(ionophore)，可以破坏高尔基体，抑制细胞内的蛋白转运； 2.BFA: 全称Brefeldin A（布雷霉素），是一种常用的蛋白转运抑制剂，特异性地可逆地阻断蛋白质从内质网(ER)转运到高尔基体(Golgi),49,胞内因子的含量与检测效果,The Leukocyte Activation Cocktail, with BD GolgiPlug is a ready -to-use polyclonal cell activat

14、ion mixture containing the phorbol ester, PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate), a calcium ionophore (Ionomycin) and the protein transport inhibitor BD GolgiPlug (Brefeldin A).,50,胞内因子的含量与检测效果,经过“开源”和“节流”之后的样本和先前的实验结果对比：,未刺激活化,刺激活化后,51,流式实验上机模版设置和结果分析,52,流式实验上机模版设置,设置上机模版需要用到： 空白对照管：去除自发荧光 同型对照管：去除非

15、特异性荧光 单阳补偿管：去除荧光泄漏 实验样本管：检测样本,53,一、空白对照管：即只有样本的对照管； 用来排除细胞的自发荧光，调节阈值、电压，设定阴性区域；,54,同型对照（Isotype Control）：使用与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的 背景染色。,二、同型对照管：即样本+同型对照抗体孵育的实验管； 用来排除细胞和抗体FC段非特异性结合产生的荧光,55,非特异荧光 产生原因分两类，一类是抗体Fc段与细胞表面的Fc受体非特异结合上的荧光染料受光照发出的荧光，可使用FCR阻断剂阻断； 另细胞损伤也会

16、导致非特异性染色，此类染色无法阻断，需用同型对照对比或进行死细胞排除。 例如：,针对红细胞的抗体,56,当使用FCr阻断剂进行阻断后同型对照依旧有较强杂信号和非特性干扰时，可用PI,7-aad,FVS等染料进行死活细胞染色排除干扰；,57,选择BD Fixable Viability Stain Reagents（FVS染料）：,FVS染色不会被固定，破膜以及洗涤步骤影响； FVS的光谱多样，适合多种染色组合的搭配，发射波普也非常集中；,58,选择BD Fixable Viability Stain Reagents（FVS染料）：,59,荧光补偿： 所谓“补偿”就是除去某一荧光素误入到其它荧

17、光通道中的发射光信号。通过调节仪器完成这一步骤。往往我们通过检测带有单一荧光素的样本来减除误入其他荧光通道的信号。既单阳管。,三、单阳管：带有单一荧光抗体的样本管 用来排除荧光补偿,*注意，实验用到几种荧光，就要制备几种单阳管*,60,完整的流式实验方案,完整的流式实验方案包括： 空白对照管：去除自发荧光 同型对照管：去除非特异性荧光 单阳补偿管：去除荧光泄漏 实验样本管：检测样本,61,阴性对照与阳性对照,通过设置阴性对照和阳性对照更好的界定实验组的样本表达情况；,62,流式上机时的仪器条件设置,阈值设定 光电倍增管电压设定 补偿调节 门与设门,63,阈值设定,流式细胞分析的对象主要是细胞和

18、微球，但实际上细胞碎片，颗粒性杂质也会被检测到。通过设定阈值可以减少后者的干扰； 每个通道阈值都可以设定。通常选择FSC通道进行阈值的设定，特定情况下会同时/或设定其他通道的阈值；,通常使用空白对照调整阈值；,64,电压设定,每一个流式通道都有自己特定的光电倍增管，其电压独立调控，在初次上机时一定都要调节到位，例如行fitc/pe双染，需调节fsc，ssc，fitc，pe4个通道的各自电压；,通常使用空白对照进行设定,电压偏低,电压合适,电压偏高,在行多色实验时，电压应该尽可能的合适甚至是稍微偏低，否则会影响到补偿调节； 电压必须先于补偿调节，改变电压补偿亦会随之改变；,65,补偿设定,通常使

19、用单阳管进行设定,光谱重叠会导致不同荧光通道间干扰，通过补偿调节将干扰信号减去，从而保证流式分析结果的正确； 调节补偿是按照“被减原则”进行；,66,Relative Intensity,650 nm,700 nm,500 nm,550 nm,600 nm,W,a,v,e,l,e,n,g,t,h,(,n,m,),Detector - % Signal,FITC Compensation,FL1,530/30,FL2,585/42,67,FITC Compensation,24.8% of the Signal Sensed in FL2,650 nm,700 nm,500 nm,550 nm,600 nm,Relative Intensity,W,a,v,e,l,e,n,g,t,h,(,n,m,),F,i,g,u,r,e,C,FL1,530/30,FL2,585/42,68,650 nm,700 nm,500 nm,600 nm,Relative In