蛋白质课件.ppt

1、1,第三章,蛋白质,2,AA-NH2与另一AA-COOH间失水形成的酰胺键称肽键，所形成的化合物称肽。,多肽的结构,3.3. 多肽,3,4,由两个AA组成的肽称为二肽。 由多个AA组成的肽则称为多肽。 组成多肽的AA单元称为氨基酸残基。,5,多肽链中AA残基按一定顺序排列：氨基酸顺序 含游离-氨基的一端：氨基端或N-端 含游离-羧基的一端：羧基端或C-端 AA顺序是从N-端开始以C-端氨基酸残基为终点 如上述五肽：Ser-Val-Tyr-Asp-Gln,6,3.3.1 肽键,7,肽键的C和N均为sp2杂化，有部分双键的性质，相关的6个原子处于共平面，称作肽平面，肽平面内两个C多处于反式构型。,

2、8,1. 多肽的两性离解 2多肽链的反应 （1）多肽链的水解 酸水解：常用6mol/L HCl回流20h，水解完全，不引起消旋，但色氨酸破坏，羟基氨基酸部分水解，酰胺键水解。 碱水解：水解完全，会引起消旋，但色氨酸不破坏。 酶水解：水解不完全，不引起消旋，色氨酸不破坏，主要用于蛋白质的部分水解。,3.3.2 多肽的性质,9,（2）氨基酸的邻基反应 （3）多肽主链的消旋化,（4）多肽的双缩脲反应 是多肽特有的颜色反应;双缩脲是两分子的尿素经加热失去一分子NH3而得到的产物。双缩脲能够与碱性硫酸铜作用，产生兰色的铜-双缩脲络合物，称为双缩脲反应。含有两个以上肽键的多肽，具有与双缩脲相似的结构特点，

3、也能发生双缩脲反应，生成紫红色或蓝紫色络合物。这是多肽定量测定的重要反应。,10,+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO- Met-脑啡肽 +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO- Leu-脑啡肽,3.3.3 天然存在的活性肽 主要有：肽类激素、肽类抗生素和肽类毒素。,1. 脑啡肽,11,2. 激素类多肽,12,促甲状腺素释放激素（TRH）,神经肽(neuropeptide),13,L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-Val L-Orn L-Orn L-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu 短杆菌肽S(环十肽) 由细菌分泌的多肽 含有D-氨基酸和一

4、些不常见氨基酸，如鸟氨酸（Ornithine, 缩写为 Orn）。,3. 抗生素类多肽,14,4. 谷胱甘肽(glutathione, GSH),结构:,15,谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽 谷氨酸的-羧基形成肽键 SH为活性基团 为酸性肽 是体内重要的还原剂,16,GSH过氧化物酶,GSH还原酶,NADPH+H+,NADP+,主要功能:,17,3.4. 蛋白质,18,球状蛋白质：globular protein 纤维状蛋白质：fibrous protein 膜蛋白质：membrane protein,3.4.1 蛋白质的分类与性质,1 蛋白质的分类,（1）、依据外形分类,19,（2）、依

5、据蛋白质的组成分类,简单蛋白 simple protein 单纯蛋白，仅由氨基酸组成 结合蛋白 conjugated protein,由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成,20,简单蛋白,清蛋白和球蛋白 albumin and globulin 广泛存在于动物组织 谷蛋白和醇溶谷蛋白 glutelin and prolamin 植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸/碱 精蛋白和组蛋白 碱性蛋白存在于细胞核 硬蛋白,21,结合蛋白,色蛋白：简单蛋白+色素物质 糖蛋白：简单蛋白+糖类物质 脂蛋白：简单蛋白+脂类结合 核蛋白：简单蛋白+核酸,22,23,2 蛋白质的性质,（1）蛋白质的两性电离,蛋白质分子除

6、两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。,24,蛋白质的等电点( isoelectric point, pI) 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。,25,酸性氨基酸pI7,碱性氨基酸pI 7。蛋白质pI与所含氨基酸种类和数量有关，若蛋白质中碱性Aa较多,其pI偏碱;如从雄性鱼类精子中提取的鱼精蛋白含Arg多,其pI 约为12,若含酸性Aa较多,则pI偏酸。 蛋白质在等电点时其溶解度、导电性、粘度、渗透压最小。 蛋白质等电点性质为电泳分离的

7、依据.,26,（2）蛋白质的胶体性质,蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万之巨，其分子的直径可达1100nm，为胶粒范围之内。,* 蛋白质胶体稳定的因素 颗粒表面电荷 水化膜,27,由于蛋白质分子很大，在水中形成胶体溶液。蛋白质主要是指球状蛋白质有亲水面，它的亲水基团都在表面，因此与水有很大的亲和力，成为亲水胶体。,蛋白质的亲水胶体溶液是相当稳定的，一方面由于蛋白质表面的亲水基团会吸引它周围的水分子，使水分子定向排列在它的周围，形成“水化层”。另一方面由于蛋白质在非等电点时带有同种电荷，同种电荷相斥，也使蛋白质分子保持一定的距离而不会聚合。,28,水化膜,溶液中蛋白质的聚沉,（3

8、）蛋白质的沉淀作用,29,1.盐析法加入中性盐脱去蛋白质的水化层，盐析一般不引起变性 2.有机溶剂沉淀法脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用 3.重金属盐沉淀法与带负电荷蛋白质结成不溶性盐 4.生物碱试剂和某些酸类沉淀法与带正电荷蛋白质生成不溶性盐 5.加热变性沉淀法天然结构解体，破坏水化层及带电状态,蛋白质的沉淀作用 ：Pr从胶体溶液中析出,30,可逆沉淀： 温和条件，改变溶液pH或Pr所带电荷 Pr结构和性质没有变化 适当条件下可重新溶解 非变性沉淀 pI沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等,31,不可逆沉淀 强烈沉淀条件 破坏Pr胶体溶液稳定性 也破坏Pr结构和性质 沉淀不能

9、再重新溶解 变性沉淀 如加热沉淀、强酸/碱沉淀、重金属盐 和生物碱沉淀等,32,概念：变性是指蛋白质受物理或化学因素的影响，使蛋白质分子原有的特定的空间结构发生改变，从而导致蛋白质性质的改变以及生物活性的丧失。,(4) 蛋白质变性（denaturation）,33,造成变性的因素： 如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等 。,34,应用举例 临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。 防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。,蛋白质变性后的性质改变： 溶解度降低、粘度增加、结晶能力消失、生物活性丧失及易受蛋白酶水解。,35,若蛋白质变性程度较轻，去除变

10、性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性。,复性(renaturation),36,天然状态，有催化活性,尿素、-巯基乙醇,去除尿素、 -巯基乙醇,非折叠状态，无活性,37,（5）蛋白质的紫外吸收,由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。,38,3.4.2 蛋白质的分离和纯化,1 蛋白质分离,要选择合适的材料; 合适的破碎方法; 合适的提取液,39,2 蛋白质分离纯化,粗分级 要方法简便，处理量大。常用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法，有时可用超过滤或凝胶过滤

11、等方法。 细分级 主要使用各种层析、电泳，方法要精心选择，巧妙配合。后期可用结晶法。,40,3 蛋白质分离纯化的基本方法,（一）根据分子大小不同的纯化方法 1、透析和超过滤,利用蛋白质分子不能透过半透膜将其 与小分子物质分开 半透膜为玻璃纸或纤维素材料,41,42,(2).离心沉淀法,43,(3).凝胶过滤 当含有各种组分的样品流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不易进入凝胶颗粒的微孔，沿凝胶颗粒的间隙以较快的速度流过凝胶柱。而小分子物质能够进入凝胶颗粒的微孔中，向下移动的速度较慢，从而使样品中各组分按相对分子质量从大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的。,44,(二) 利用溶解

12、度差别的纯化方法 (1).等电点沉淀和pH控制 利用蛋白质在等电点时溶解度最低以及不同的蛋白质具有不同等电点一这特性，对蛋白质进行分离纯化的方法称为等电点沉淀法。 在等电点时，蛋白质分子的净电荷为零，消除了分子间的静电斥力，但由于水膜的存在，蛋白质仍有一定的溶解度而沉淀不完全，所以等电沉淀法经常与盐析法或有机溶剂沉淀法联合使用。 单独使用等电点法主要是用于去除等电点相距较大的杂蛋白。在加酸或加碱调节pH的过程中，要一边搅拌一边慢慢加入，以防止局部过酸或过碱 。,45,(2).蛋白质的盐溶和盐析 定义：一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这种现象称为盐溶；而当盐浓度升高到

13、一定程度后，蛋白质的溶解度又随着盐浓度的升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出，这种现象称为盐析作用。在同一浓度的盐溶液中，不同蛋白质的溶解度不同，借此可达到彼此分离的目的。 原理：盐浓度增高到一定数值后，水活性降低，水化膜相继被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚积并从溶液中析出。,46,47,(3).有机溶剂分级分离法 A 作用机理： （1）降低水溶液的介电常数，使溶质溶解度降低； （2）破坏大分子周围水膜，使溶解度降低。 利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度不同而使蛋白质分离的方法，称为有机溶剂沉淀法。经常使用的有机溶剂是乙醇和丙酮。 B 优点： 比盐析法析出的沉淀容易过滤或离心分离，分辨

14、力比盐析法好，溶剂也容易除去。,48,C 缺点： 有机溶剂沉淀法易使蛋白质和酶变性，所以操作必须在低温条件下进行。蛋白质和酶沉淀分离后，应立即用水或缓冲液溶解，以降低有机溶剂浓度，避免变性。 中性盐可减少有机溶剂引起的蛋白质变性，提高分离效果，一般添加0.05mol/L的中性盐。由于中性盐会增加蛋白质在有机溶剂中的溶解度，故中性盐不宜添加太多。 有机溶剂沉淀法一般与等电点沉淀法联合使用。即操作时溶液的pH值应控制在欲分离蛋白质的等电点附近。,49,(三) 根据电荷不同的纯化方法,(1)离子交换色谱法,离子交换层析是根据蛋白质所带电荷的不同进行分离纯化。常用的阳离子交换剂为羧甲基纤维素（CM-C），阴离子交换剂为二乙氨基乙基纤维素（DEAE-C）。,50,51,(2). 电泳,52,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),53,(四) 利用选择性吸附的纯化方法 (1).吸附层析,羟基磷灰石Ca5(PO4)3OH2(简称HA)的吸附容量高，稳定性好(在T85，pH5.5-10.0均可使用)，因此在制备及纯化蛋白质、酶、核酸、病毒和其它生命物质方面得到了广泛的应用。有时有些样品如RNA、双链DNA、单链DNA和杂合型双链DNA-RNA等，经过一次HA柱层析，就能达到有效的分离。,54,(2)亲和色谱法 是利用生