抗体制备过程

1、单克隆抗体制备工艺，临床兽医学系，吴黎明，0830，2110124，单克隆抗体技术的基本原理小鼠骨髓瘤细胞可以无限增殖，在体外分泌无抗体活性的免疫球蛋白，而免疫小鼠脾细胞有产生抗体的能力，但不能无限增殖，还能产生特异性抗体，可用有限稀释法筛选培养，成为单细胞增殖产生的克隆。如果克隆不突变，可以大量生产高特异性和高纯度的单克隆抗体。单克隆抗体的优点1。目的明确人可以根据自己的需要在动物体内或体外产生不同类型的单克隆抗体。任何抗原、半抗原，包括各种细菌、病毒、激素、酶、氨基酸序列、核酸和其他外源蛋白或糖蛋白，都可以用于免疫动物，相应的单克隆抗体可以通过杂交瘤技术获得。高特异性单克隆抗体是针对特定抗

2、原或抗原上的特定决定簇制备的，与其他抗原无交叉反应性。与其他常规免疫血清相比，单克隆抗体具有特异性高、效价高、质地均匀等优点，便于精制和浓缩。单克隆抗体的应用可以提高检测方法的灵敏度和特异性。同时，它可以作为纯化抗原、制备疫苗、生产生物制剂和在基础研究中使用它们的重要手段。3.生产简单，易于标准化。一旦成功培育出高滴度的杂交瘤细胞系，经鉴定合格后，可在液氮中长期保存。如果没有突变和染色体丢失，可以长期大量生产高特异性和高纯度的单克隆抗体。单克隆抗体制备示意图：1。细胞融合前的准备；1.免疫方案选择合适的免疫方案对细胞融合杂交的成功和获得高质量的单克隆抗体非常重要。一般来说，应在融合前约两个月建

3、立免疫程序，以开始初次免疫，免疫程序应根据抗原的不同特性确定。可溶性抗原免疫原性弱，因此通常添加佐剂。常用的佐剂包括弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂以等体积混合在一起，研磨成油包水乳剂，并在水面上滴一滴，这很难立即扩散，表明它已经达到油包水的状态。第一次免疫用Ag150g和弗氏完全佐剂皮下多点注射(一般为0.81ml0.2ml点)与第二次免疫3周后的剂量相同，第三次免疫3周后用弗氏不完全佐剂皮下或IP(IP剂量不应超过0.5ml)与第三次免疫3周后的剂量相同，不含佐剂，且IP(57天后，取血检验其效力并检验其免疫效果)在23周后加强免疫。合适的剂量为50，500克，注射胰岛素或静脉

4、注射3天后，应取脾进行融合。(2)在制备单克隆抗体的过程中，需要在许多环节添加饲养细胞，例如，在杂交瘤细胞的筛选、克隆和扩大培养过程中，需要添加饲养细胞。小鼠腹腔巨噬细胞由与免疫小鼠相同的菌株制备。BaLbc小鼠在610周龄时被杀死，浸泡在75度酒精中。消毒35分钟后，用无菌剪刀切开皮肤。用无菌注射器注入68毫升培养液，反复冲洗暴露的腹膜，将冲洗液吸出并放入10毫升离心管中。将1200转的心脏悬浮在20牛血清(NCS)或胎牛血清(FCS)的培养基中56分钟，并将细胞数调节至110毫升，将其加入到96孔板中，并将100毫升孔放入37CO2培养箱中进行培养。通常，在融合前一天制备饲养细胞，并且可以

5、从一只小鼠获得58106腹膜巨噬细胞。如果小鼠胸腺细胞用作饲养细胞，细胞浓度为5106毫升。(3)骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞系应与免疫动物属于同一品系，因此杂交融合率高，便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量单克隆抗体。常用的骨髓瘤细胞通常，骨髓瘤细胞应在准备融合前两周复苏。为了确保细胞对HAT的敏感性，每36个月应使用8AG(8氮杂鸟嘌呤)以防止细胞突变。细胞融合的关键是保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，形态良好，活细胞数大于95。在细胞融合前一天，用新鲜培养基将细胞浓度设定为2105/ml，第二天通常是对数生长细胞。(4)脾细胞免疫脾细胞免疫是指处于免疫状态的脾脏中的B淋巴细胞母细胞。一般来

6、说，最后一次加强免疫后3天取脾，制成细胞悬液。此时，B淋巴细胞比例大，融合成功率高。脾细胞悬液的制备：在无菌条件下取出脾脏，用不完全培养液冲洗一次，放在不锈钢筛网上的平板上，用注射器针芯研磨成细胞悬液，计数。一般来说，免疫后的脾脏体积约为正常小鼠的两倍，细胞数约为10个。(1)取对数骨髓瘤细胞SP20，以1000转/分钟离心5分钟，弃去上清液，用不完全培养液悬浮细胞，计数，取所需细胞数，用不完全培养液洗涤两次。(2)同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤两次。(3)将骨髓瘤细胞和脾细胞按110或15的比例混合在一起，用不完全培养液在50毫升塑料离心管中以1200转/分钟的速度洗涤一次，8分

7、钟。(4)弃去上清液，用滴管吸取残液，以免影响聚乙二醇的浓度。(5)轻轻弹起离心管底部，使细胞沉淀稍微松动。(6)为了在室温下熔融，可以在30秒内通过预热403360加入1毫升含有5DMSO的预热的45聚乙二醇(梅雷克，分子量4000)，并且在加入的同时搅拌混合物。持续90秒，如果冬天室内温度低，可以延长到120秒。加入预热的不完全培养基停止聚乙二醇，每分钟加入1毫升、2毫升、3毫升、4毫升、5毫升和10毫升。(7)以800转/分钟离心6分钟。(8)弃去上清液，用约6毫升20牛血清RPMI1640轻轻悬浮。记住不要用力吹气，以免分散融合的细胞。(9)根据所用96孔培养板的数量，加入完整的培养液

8、和10毫升一个96孔培养板。(10)将融合的细胞悬浮液加入到含有饲养细胞、100升孔、37和5CO2培养箱的96孔板中进行培养(通常，一个96孔板含有1107个脾细胞)。(11)在第3、6、9和10天，含有HAT的完整1640培养基被更换。注意轻吸上清液，不要吸出固定在孔底的细胞，根据需要加入适量的饲养细胞。(12)在第12天和第15天，加入含有HAT的完整的1640培养基。杂交瘤细胞可在每次更换液体前约10天用倒置显微镜观察。大多数杂交瘤细胞在1020天内出现，但有些只能在约1个月内出现。杂交瘤细胞出现后，收集上清液并检测抗体。(13)继续生长的杂交瘤细胞的增殖和传代。在通过过程中，HAT方

9、案和完整的1640方案被取消，取而代之的是1040方案。同时，它被储存在液氮中并被克隆，在此期间，每一代人都应该检查抗体以防止抗体产生细胞的变异和丢失。(2) HAT选择性杂交瘤通常融合24小时，然后加入HAT选择性培养基。HT和HAT均与市售试剂50一起储存，并将1毫升加入到50毫升20牛血清完全培养基中。因为饲养细胞和融合细胞已经加入到培养板中，所以有200升孔。因此，在添加选择性培养基时，应添加3倍量的HAT。我们认为融合后的初始补充量可以选择总量的23%，可以获得满意的筛选结果。50 HAT h:510-3m 3360210-5mt 3360810-4m一般选择HAT选择性培养基维持培

10、养两周，然后切换到HT培养基，再维持培养两周，然后切换到普通培养基。(3)抗体检测，杂交瘤细胞的筛选在通过选择性培养获得的杂交瘤细胞系中，只有少数能分泌针对免疫原的特异性抗体。通常，当杂交瘤细胞被覆盖时HAT筛选的杂交瘤克隆不能保证一个孔中只有一个克隆。实际上，可能有几个甚至更多的克隆。为了将这些细胞相互分离，需要克隆。克隆的原则是尽快克隆抗体阳性的杂交克隆，否则抗体分泌细胞将被抗体分泌细胞抑制。即使是克隆的杂交瘤细胞也需要定期进行再克隆，以防止杂交瘤细胞发生突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。1。有限稀释法的程序是制备饲养细胞悬液(融合前制备)阳性孔的细胞数，并将细胞数调节至1510毫

11、升，将130个细胞放入含饲养细胞的6.5毫升完整培养基中，即20个细胞毫升，100升孔加三排甲、乙、丙，每孔2个细胞。用含有饲养细胞的2.9毫升完全培养基补充剩余的2.9毫升细胞悬液，细胞数为10毫升，向100毫升孔中加入三排d、e和f，每孔一个细胞。用含有饲养细胞的2.2毫升完全培养基补充剩余的2.2毫升细胞悬浮液，加入5毫升细胞、100升孔和两行g和h，每孔0.5个细胞。培养45天后，在倒置显微镜下可以看到小细胞克隆，并加入200升完全培养基。第89天，肉眼可见细胞克隆，并及时进行抗体检测。注释：首次克隆的杂交瘤细胞需要在完整的培养基中加入羟色胺。2.软琼脂法制备软琼脂RPMI1640 1

12、含20FCS(小牛血清)的琼脂水溶液两次浓缩：高压灭菌，42次预热。0.5琼脂：加入1份1琼脂和1份含20份小牛血清的RPMI1640制成。42岁时保持温暖。将15毫升上述0.5琼脂溶液(含有饲养细胞)倒入直径为9厘米的平板中，在室温下固化，用作基层以备后用。根据100毫升、500毫升或5000毫升的浓度，制备待克隆的细胞悬液。室温下，将1毫升0.5琼脂溶液(预热至42)与1毫升细胞悬浮液混合。混合后，立即将其倒在琼脂基质上，在室温下固化10分钟，并在37，5 5CO2培养箱中培养。45天后，可以看到针尖大小的白色克隆，710天后，将它们直接移植到含有饲养细胞的24孔板中进行培养。检测抗体，扩

13、大培养，必要时再次克隆。(2)杂交瘤细胞的冷冻保存将杂交瘤细胞冷冻在原始孔中以及每次克隆获得的亚克隆细胞及时冷冻是非常重要的。因为当没有建立稳定的抗体分泌细胞系时，细胞培养过程中的任何时候都可能发生细胞污染和抗体分泌能力的丧失。如果没有原始细胞的冷冻保存，它将因上述事故而被丢弃。杂交瘤细胞的冷冻保存方法与其他细胞系相同。原则上，每个安瓿中的细胞应超过1106个，但具有原始孔的杂交瘤细胞可因不同的培养环境而改变，并在24孔培养板中培养。当每个孔的底部装满时，可以冷冻一个安瓿。细胞冷冻保存液： 50小牛血清40不完全培养液10二甲基亚砜。5.单克隆抗体的大量生产。大量生产单克隆抗体有两种主要方法：

14、1 .在体外，杂交瘤细胞在旋转培养管中培养，从上清液中获得单克隆抗体。然而，这种方法的产量较低，一般培养基含量为1060gml。如果进行大规模生产，成本很高。2.体内接种杂交瘤细胞制备腹水或血清。采用实体瘤法，将13107ml杂交瘤细胞接种于小鼠背部皮下，每处注射0.2 ml，共24个点。肿瘤达到一定大小后(一般为1020天)，可采集血液，从血清中获得的单克隆抗体含量可达1-10毫升。但是采血量是有限的。腹水的常规制备方法是腹腔注射0.5毫升石油醚或液体石蜡，12周后腹腔注射1106杂交瘤细胞。接种710天后会产生腹水。密切观察动物的健康状况和腹水的迹象，当有尽可能多的腹水时，在小鼠死亡前将其

15、杀死，用滴管将腹水吸入试管。通常腹水中单克隆抗体含量可达5-20毫克/毫升，是目前最常用的方法。腹水中的细胞也可以冷冻。复苏后，移植小鼠腹腔内可迅速大量产生腹水。6.单克隆抗体的鉴定有必要对制备的单克隆抗体进行系统的鉴定。应确定以下方面： 1。抗体特异性的鉴定：除了用免疫原(抗原)检测抗体外，还应使用与其抗原成分相关的其他抗原进行交叉试验，并可使用酶联免疫吸附法和IFA法。例如，为了制备抗黑色素瘤细胞的单克隆抗体，除了与黑色素瘤细胞反应之外，其它器官的肿瘤细胞和正常细胞也用于交叉反应，从而选择抗肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的单克隆抗体。制备抗重组细胞因子的单克隆抗体，首先要考虑是否与表达菌株的蛋白质发生交叉反应，然后再考虑是否与其他细胞因子发生交叉反应。2.免疫球蛋白类和2亚类的鉴定。单克隆抗体：一般来说，当用酶标记或荧光素标记的二级抗体进行筛选时，抗体的免疫球蛋白类型已经基本确定。如果使用酶标记或荧光标记的兔抗鼠IgG或IgM，检测到的抗体通常是IgG或IgM。对于亚类，有必要使用标准的抗亚类血清系统进行双扩增或夹心酶联免疫吸附试验来确定单克隆抗体的亚类。在双膨胀