植物病理学研究方法.第6章第2节.ppt

1、2020/7/26 吉林农业大学,1,植物病理学基础研究方法 （第6章第2节) 分子生物学技术在植物病原物鉴定、检测中的应用,2020/7/26 吉林农业大学,2,第二节 分子生物学技术在植物病 原物鉴定、检测中的应用,分子生物学技术已经应用于一切生物学领域。在植物病理学研究中已应用于植物病原物的鉴定、检测，抗病基因的克隆以及抗病转基因植物的培育中。 本节中主要学习应用PCR及相关技术进行植物病原物的鉴定、检测等问题。,2020/7/26 吉林农业大学,3,第二节 分子生物学技术在植物病 原物鉴定、检测中的应用,一. PCR（聚合酶链反应）技术 （一）PCR的原理 （二）PCR技术的操作 （三

2、）PCR技术的发展 （四）PCR技术在植物病理学中的应用 二. RAPD方法 与 SCAR标记 三. RFLP 和 AFLP技术 四. 核酸序列分析,2020/7/26 吉林农业大学,4,一 .PCR（聚合酶链反应）技术,PCR（polymerase chain reaction）技术，即“聚合酶链反应”，是体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，由美国科学家Mullis于19831985年发明。 该技术模拟发生于生物细胞内的DNA复制过程，无需繁琐的基因克隆程序便可在数小时内获得大量拷贝的特异DNA片段，其步骤简便，结果可靠，为研究和分析基因提供了一种全新的方法，被誉为分子生物学技术上的一场

3、革命，在生物学各个领域都得到广泛的应用。 Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。,2020/7/26 吉林农业大学,5,（一）PCR的原理,PCR的原理与体内DNA复制的过程相似，它模拟DNA聚合酶在生物体内的催化作用，在体外进行特异DNA序列的聚合和扩增。,2020/7/26 吉林农业大学,6,生物体内 DNA分子的结构和复制,2020/7/26 吉林农业大学,7,DNA的结构,2020/7/26 吉林农业大学,8,DNA的结构:4种脱氧核苷酸组成,氢键,磷酸二酯键,3-OH,3-OH,3-OH 使dNTP 依次连接,磷酸,脱氧 核糖,2020/7/26 吉林农业大学,9,DNA复制的方

4、向：新链只能从5端 3端,5端和3端： 磷酸基团的末端称为5端。 DNA的核糖的羟基末端称为3端。,3-OH 使dNTP依次聚合,2020/7/26 吉林农业大学,10,DNA复制的酶学,底物:dNTP 即dTTP dATP dCTP dGTP 酶:DNA聚合酶(polymerase), 拓扑异构酶,解螺旋酶,引物酶, DNA连接酶(ligase)。 模板(template):解开成单链的DNA母链 引物(primer): 提供3-OH使dNTP依次聚合。 蛋白因子：单链结合蛋白(SSB)。,众所周知，是由四种碱基按互补配对原则（即腺嘌呤对胸腺嘧啶，鸟嘌呤对胞嘧啶）组成的螺旋双链。 在细胞内，

5、复制时，解螺旋酶首先解开双链让它变成单链做为模板，然后，引物酶合成一小段引物结合到模板上，最 后， DNA聚合酶以这段引物为起点，合成与模板配对的新链。,2020/7/26 吉林农业大学,11,DNA复制的起始就是要解开双链和生成 引物。 (一)DNA解成单链 由拓扑异构酶松弛超螺旋，解螺旋酶 解开双链，SSB结合到单链上使其稳定。,生物体内 DNA分子的结构和复制,2020/7/26 吉林农业大学,12,(二)引物合成引发体引导引物酶到达适当的位置合成引物。引物长度约为十几个到几十个核 苷酸不等。引物的合成方向也是53方向。,2020/7/26 吉林农业大学,13,(三)延伸(elongat

6、ion)： 复制体延DNA移动， dNTP依次聚合。,2020/7/26 吉林农业大学,14,生物体外 DNA分子的复制 PCR技术,2020/7/26 吉林农业大学,15,PCR的3个基本反应,即是在体外模拟复制的过程，它用加热的办法让所研究的片段变性变成两条单链，人工合成两个引物让它们结合到模板的两端，聚合酶即可以大量复制该模板。 PCR是由3个基本反应: 变性、退火、延伸 3步反应周期反复循环。 每循环一次所产生的DNA均能成为下一次循环的模板。 20次PCR循环将产生约一百万倍(220)的扩增产物。,2020/7/26 吉林农业大学,16,变性（双链DNA解链成单链）,1.变性： 将反

7、应体系 置高温下 (9194,1min), DNA双螺旋的氢键断裂(变性)，形成单链DNA。,模板DNA、引物1、引物2、dNTP和TaqDNA聚合酶、 Mg2+、 Buffer 模板DNA： 含有待扩增区域的DNA 特异性引物:与模板DNA待扩增区域两端已知序列互补的寡核苷酸 dNTP ：带有A、T、G、C的单核苷酸（脱氧核苷三磷酸） TaqDNA聚合酶： 催化DNA复制的酶 Mg2+ :保证DNA复制的酶活性 Buffer：缓冲液,退火（按碱基配对原则结合形成双链区）,2.退火： 使温度下降 (3765,1min)， PCR反应体系中的引物与模板链3端互补区退火（按碱基配对原则结合形成局部

8、双链区），引物与模板结合。,由于DNA聚合酶需要有一小段双链DNA来启动（引导）新链的合成（在生物体内也如此），于是，TaqDNA聚合酶将单核苷酸从引物的3端引入，催化磷酸二脂键生成。 引物的关键作用有二： 启动新链的合成； 引物的退火位点决定新DNA链的起点。,2020/7/26 吉林农业大学,18,延伸（ DNA合成链的延伸）,3.延伸；72，2min, 在适当的缓冲液中， Mg2+存在条件下， Taq DNA聚合酶按模板的碱基顺序不断引入4种dNTP（脱氧核苷三磷酸）合成互补链，按53的方向不断延伸。 由于两引物都是按与扩增区段两端序列彼此互补的原则设计的，在每一条新合成的DNA链上都具

9、有新的引物结合位点。,2020/7/26 吉林农业大学,19,从退火到延伸,有人问：退火时为什么引物与模板杂交，而模板双链不复性呢？ 原因： 一是相对模板DNA来说引物的量大； 二是模板DNA比引物分子量大且复杂。 所以在复性时，引物与模板在局部形成杂交链的机会比模板复性要大得多。,引物1,引物1,引物2,引物2,2020/7/26 吉林农业大学,20,PCR扩增过程,2020/7/26 吉林农业大学,21,重复13步 2530轮,目的DNA片段 扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链 与引物复性,DNA变性 形成2条单链,子链延伸 DNA加倍,PCR扩增过程,2020/7/26 吉林农

10、业大学,22,PCR仪基因体外扩增仪；热 循 环 仪,2020/7/26 吉林农业大学,23,（二）PCR技术的操作,冰上向管中依次加入下列试剂： 总体积 25l 10Buffer 2.5l MgCl2 2 mmol/L dNTP 0.2mol/L（4种dNTP各1/4） 引物 0.2mol/L 模板 10ng Taq酶 2L 双蒸水 补至终体积,微量移液器的使用方法,1)吸进液体时按到第一档，垂直进入液面几毫米。缓慢松开控制按钮，防止液体进入吸头过速会导致液体倒吸人移液器内部吸入体积减少。 2)打出液体时贴壁并有一定角度，先按到第一档，稍微停顿1s后，待剩余液体聚集后，再按到第二档将剩余液体

11、全部压出。,2020/7/26 吉林农业大学,25,反应循环参数,反应管放入PCR仪中， 按如下程序操作： 94预变性 2 5min 94变性 1 min 4562退火 1 min 72延伸 2 min 循环30次 72延伸 7 min （以保证扩增出来的片段都是全长的） 循环结束后反应产物置于4保存,2020/7/26 吉林农业大学,26,PCR条件的优化：,在PCR反应中主要影响因素有： 模板、 Mg2+ 、 三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）、 引物、 Taq DNA聚合酶、 温度循环参数。,2020/7/26 吉林农业大学,27, 模板量,模板的纯度及量对反应有重要的影响。 一般含量在210

12、0ng均能获得目标产物。 模板的量过少可能PCR产物在琼脂糖凝胶电泳中不能被检测出来； 模板量太大也会影响PCR的效率，并且会出现非特异产物。 模板可用总DNA，一般不需高度纯化，甚至煮沸细胞释放出DNA也可作模板。,2020/7/26 吉林农业大学,28, Mg2+浓度,Mg2+是Taq DNA聚合酶活性所必需的。 不同的引物-模板系统，最适合的Mg2+浓度可能不同。 Mg2+浓度过低，酶活力显著降低； 浓度过高催化非特异扩增。 通常适合的Mg2+为0.55.0mmol/L， 需做预备实验来选定。,2020/7/26 吉林农业大学,29, dNTP浓度,反应中每种dNTP的终浓度为20200

13、mol/L时， PCR产物量、特异性与合成忠实性间的平衡最佳。 适宜dNTP浓度可根据靶序列长度和碱基组成来确定。,2020/7/26 吉林农业大学,30, 引物浓度,一般PCR体系中引物的终浓度为0.20.5mol/L，在此范围内，PCR产物量基本相同。 但引物量低于0.2mol/L时，PCR产物量降低； 引物量过高会促使非特异产物的合成，还会增加引物二聚体的形成。,2020/7/26 吉林农业大学,31, 退火温度,退火温度直接影响扩增的特异性， 退火温度高则扩增特异性高，但PCR产物量低； 退火温度过低易导致非特异性扩增。 需进行预备实验选择适宜退火温度。,2020/7/26 吉林农业大

14、学,32,Taq DNA聚合酶浓度,在其它参数最佳时， 100L反应液含12.5L Taq DNA聚合酶为佳。 如果酶浓度太高易出现非特异扩增带； 酶浓度过低时，则靶序列产量很低。,2020/7/26 吉林农业大学,33,热启动可提高特异性、扩增效率,采用热启动可提高特异性， 还可提高扩增效率。 方法为： 反应体系的最后1种成分（如Taq DNA聚合酶）暂不加入， 加热到80或更高再加入， 接着将样品管加热到94直接进入PCR循环。,2020/7/26 吉林农业大学,34,分子生物学技术重要参考书,2020/7/26 吉林农业大学,35,DNA的提取和检测,为进行DNA的扩增，首先要进行DNA

15、的提取和检测。 DNA提取的不同方法： CTAB 、SDS、尿素法、SDSCTAB、浓盐法等 紫外吸收法测定核酸种类、含量,2020/7/26 吉林农业大学,36,DNA提取的方法,细胞破碎 抽提去蛋白质 沉淀核酸,植物DNA提取的基本过程,植物DNA提取的不同方法,CTAB （溴代十六烷基三甲胺）法 CTAB是一种去污剂，可溶解细胞膜并能与核酸形成复合物，便于DNA的抽提；还可保护DNA免受内源核酸酶的降解，使蛋白质变性而沉淀。 1CTAB（溴代十六烷基三甲胺） DNA提取液 1%（W:V） CTAB 50mmol/L Tris-HCl（pH8.0） 10mmol/L Na2EDTA 0.7

16、mol/L NaCl SDS（十二烷基硫酸钠）法 可溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使蛋白质变性而沉淀。 浓盐法（RNA能溶于0.14mol/L的NaCl溶液中，而DNA难溶其中，据此特性可将两者分开。DNA易溶于0.51 mol/L的NaCl溶液中，因此可利用1 mol/L的NaCl溶液提取DNA。） 尿素法：尿素是一种变性剂，如68mol/L尿素为中强变性剂。 蛋白质在受热或在高浓度的尿素、盐酸胍（8M脲和5M盐酸胍）等化学试剂存在下会丧失活性，该现象称为蛋白质的变性。,植物DNA提取方法的要点,细胞破碎细胞（匀）浆可用机械破碎法：如研磨。 核酸分离、纯化应在04，以防核酸变性或降解。 Tris缓

17、冲液 Tris的化学性质稳定，作用是保持溶液的电中性及pH。 在提取液中加入适量EDTA或柠檬酸盐可抑制Dnase活性，又可使蛋白质变性而与核酸分离。 -巯基乙醇具还原剂性质，能防止过氧化物对分离物的破坏、分解。 从核酸样品中除去蛋白质时常常使用苯酚/氯仿/异戊醇（25 : 24 : 1)。苯酚/氯仿可与水作用能破坏蛋白质分子周围的水膜，同时改变溶液的介电常数，导致蛋白质变性溶解度降低而沉淀析出。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。加入异戊醇能降低分子表面张力，能减少抽提过程中的泡沫产生。 异丙醇、乙醇可选择性的沉淀DNA，而

18、RNA仍留在溶液中。,抽提DNA去除蛋白质时，怎样使用酚与氯仿较好？ 酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约1015的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA。氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA。所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。 为什么用酚与氯仿抽提DNA时，还要加少量的异戊酵？ 在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少泡沫产生，同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。 一般采用酚、氯仿与异

19、戊醇之比为25：24:1（不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24：1的氯仿与异戊醇即成）。,2020/7/26 吉林农业大学,41,实验材料研磨加入提取液获得植物汁液,研钵及其它容器应事先高压灭菌，再烘干。,植物汁液加入离心管,2020/7/26 吉林农业大学,42,DNA提取的重要仪器高速离心机,离心管加入离心机前 必须对离心管 进行配平衡,打开离心机的盖子,离心管放入离心机转子,离心管的正确放置,插好离心管,紫外吸收法测定核酸种类及含量,原理：DNA和RNA的吸收峰在260nm处。蛋白质由于含有芳香族氨基酸，吸收峰在280nm处，在260nm处的吸收值仅为核酸的十分之一或更低，故核酸样品

20、中蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。 RNA的260nm和280nm吸收的比值在2.0以上， DNA的260nm和280nm吸收的比值在1.9左右， 当样品中蛋白质含量较高时比值即下降(比值1.8，表示蛋白质含量不超过0.3)。 在实际测定中，将样品稀释成每mL含550g核酸的浓度，可利用在260nm下的吸收值来求出核酸的浓度。 DNA浓度（g/mL）A260/0.020/L*稀释倍数 式中： A260为260nm下的吸收值； L为比色池厚度，一般为1或0.5； 0.020为每mL溶液内含1gDNA钠盐的吸光度.,紫外可见光分光光度计,2020/7/26 吉林农业大学,45,琼脂糖凝胶

21、电泳检测DNA 扩增产物,由于DNA核酸分子比蛋白质分子大得多，通常采用有较大孔径的琼脂糖凝胶来分离核酸。 由于核酸分子本身中含有大量的磷酸根，所以带有负电荷，在电场中会向正极移动。 试剂和仪器 水平电泳槽、电泳仪,2020/7/26 吉林农业大学,46,PCR仪基因体外扩增仪,PCR仪配套用品,2020/7/26 吉林农业大学,47,PCR扩增产物的琼脂糖电泳分析Anaysing the results of a PCR by agarose gel electrophoresis,待分析的DNA样本,2020/7/26 吉林农业大学,48,水平电泳槽、电泳仪,2020/7/26 吉林农业大

22、学,49,制备凝胶板,2020/7/26 吉林农业大学,50,加样,2020/7/26 吉林农业大学,51,水平电泳图示,凝胶板上的电泳条带,凝胶板上的电泳前端 用溴酚蓝指示,加样孔,2020/7/26 吉林农业大学,52,电泳分离不同大小的DNA片断,2020/7/26 吉林农业大学,53,凝胶成像仪,凝胶板上的 电泳条带,2020/7/26 吉林农业大学,54,（三）PCR技术的发展,以PCR 技术为基础与其它最新技术相结合, 进一步发展了反转录PCR 、免疫捕捉PCR 、实时荧光定量PCR 、多重聚合酶链反应等复合PCR技术。 这些方法提供了更快捷、特异、准确、高效检测植物病原物的方法.

23、,2020/7/26 吉林农业大学,55,1.反转录PCR （RT-PCR）,1.反转录PCR （RT-PCR） 目前PCR 技术只能扩增DNA模板， 而Taq DNA聚合酶不能以RNA为模板进行扩增。 利用逆转录酶能将RNA逆转录成DNA的特性， 通过合适的引物，将RNA（一般为mRNA)逆转录成cDNA， 然后，通过PCR技术，将痕量的cDNA扩增成大量的双链DNA。 这种在RNA 反转录后进行的PCR 扩增称为RT-PCR （Reverse transcription PCR,简称RT-PCR）。 大多数植物病毒基因组为RNA，为检测植物病毒，就需要应用反转录PCR技术，首先在逆转录酶的

24、作用下，以RNA为模板合成互补的第一链cDNA，之后进行常规PCR反应。,cDNA：互补DNA，具有DNA的功能，且其中没有内含子。,逆转录示意图,cDNA 链合成, 互补 mRNA链，一般利用polyT作引物，也可用特异性的序列作为引物,G U A A U C C U CAAAAAAAAAAAAAAA,Reverse transcriptase,mRNA,cDNA,T T A G G A G,TTTTTTTTTTTTTTT,逆转录polyT引物,2020/7/26 吉林农业大学,57,反转录PCR原理示意图,逆转录酶,聚合酶,RNA,cDNA,杂化双链,PCR扩增,将mRNA逆转录成cDNA

25、 这个步骤与转录是相反的，因此叫逆转录酶。 逆转录酶 （reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶。 至少具有以下三种活性：1、依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链；2、Rnase水解活性：水解RNA/DNA杂合体中的RNA；3、依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA。,Taq 酶,2020/7/26 吉林农业大学,58,反转录PCR,cDNA,2020/7/26 吉林农业大学,59,RTPCR检测番木瓜环斑病毒电泳结果,2020/7/26 吉林农业大学,60,2.免疫捕捉PCR（

26、IC-RT PCR）,特异性抗体,抗原,2.免疫捕捉PCR（IC-RT PCR） 是根据ELISA 的原理，直接从植物粗提液中进行免疫捕捉病毒，目的在于浓缩和纯化病毒粒子，之后再利用RT-PCR 检测目的片断。 基本流程 （反应在0.5mL离心管中进行）： 包被抗体 捕捉抗原 病毒核酸释放（98，3min） 反转录反应 PCR扩增 产物检测。,反转录 PCR 反应体系,离心管,反转录反应 PCR扩增,2020/7/26 吉林农业大学,61,免疫捕捉PCR有以下优点,免疫捕捉PCR具有以下优点: (1)在PCR 扩增前，有免疫捕捉的过程以及引物的高度特异性, 提高了检测的灵敏度（上百倍）。 EL

27、ISA 一般能够检测到的病毒浓度是1ng/mL, 但是IC-RT PCR 一般只需要110pg/mL. (2)能直接从植物粗提液中检测病原物，而省去PCR 模板的纯化,这对于核酸提取困难的样品特别适用。利用抗原与抗体的结合，能除去植物粗提液中的PCR抑制物。,2020/7/26 吉林农业大学,62,3.实时荧光定量PCR,3.实时荧光定量PCR (Real time fluorescent Quantitative PCR， RT-FQ PCR) 是美国PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术，简称FQ-PCR。该技术是在 PCR 反应体系中加入非特异性的荧

28、光染料（如： SYBR GREEN ）或特异性的荧光探针（如： Taqman 探针），实时检测荧光量的变化。获得不同样品达到一定的荧光信号（阈值）时所需的循环次数 CT 值（ Cycle Threshold ）；通过将已知浓度标准品的 CT 值与其浓度的对数绘制标准曲线，就可以准确定量样品的浓度。 FQ-PCR是PCR反应一面进行，机器一面利用萤光侦测技术与计算机分析技术记录PCR的反应结果，当反应完成时，检验结果就立即呈现。,SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位,SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光。 变性时，DNA双链分开，无荧光。 复性和延伸时，形成双链DN

29、A，SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。 SYBR Green法优点：使用方便-不必设计复杂探针，非常灵敏，便宜。 SYBR Green法缺点：容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性 。,SYBR Green,实时荧光定量PCR 方法1 - SYBR Green 法,实时荧光定量PCR 方法2 -TaqMan法,另一波长的光,在常规PCR基础上，反应体系添加 “荧光双标记探针”， 探针的5端为荧光报告基团，3端为荧光淬灭基团， 两者构成能量传递结构， 5端荧光报告基团的荧光可被荧光淬灭基团吸收掉，转化为其他波长的发射光或热能，称之为FRET。 在目标DNA扩增过程中，探针水解

30、，荧光素和淬灭剂分开，淬灭剂对荧光素的抑制作用消失，从而引起报告基团荧光信号的增长。 由于探针必须遇到模板才能实现水解，故非特异性扩增不会被检测。,2020/7/26 吉林农业大学,65,实时荧光定量PCR 方法3 -分 子 信 标法,荧光基团,在目标DNA扩增过程中，分子信标型探针构型变化，荧光素和淬灭剂分开，淬灭剂对荧光素的抑制作用消失，从而引起报告基团荧光信号的增长。,标记荧光的发夹探针： 环与目标序列互补 茎由互补配对序列组成,2020/7/26 吉林农业大学,66,实时荧光定量PCR对起始DNA的定量方法,实时荧光定量PCR对起始DNA的定量方法为： 原理：初始 DNA量越多, 荧光

31、达到某一值（ Ct阈值）时所需要的循环数越少。 Ct值和初始DNA量的对数值呈线性关系。 制定标准品的Ct值和初始DNA量的对数值之间的标准曲线。 根据样品的Ct值就可准确定出起始DNA数量。,Ct值（Cycle threshold） ：指在PCR循环过程中荧光信号到达设定的域值的循环次数。 经数学证明，Ct值与模板DNA的起始拷贝数的关系： NN0(1+E)n logN= n log(1+E) + logN0 n = (logN0 - logN) / log (1+E) Ct =A + BlogN0,2020/7/26 吉林农业大学,67,4.多重聚合酶链反应,4.多重聚合酶链反应 （Mul

32、tiplex PCR） 不同的植物病毒或其它病原物可能会同时侵染同一种植物， 如要逐个检测，操作较为繁琐。 多重聚合酶链反应技术可在一次PCR反应中，同时加入几对特异性引物(要注意各引物比例适当)，从而同时扩增、检测出不同的病原物(DNA 或者RNA). 这就为检测工作提供了极大的便利。,2020/7/26 吉林农业大学,68,（四）PCR技术在植物病理学中的应用,1. 检测病原物的种类 2. 检测病原物的数量 3. 分析转基因植物外源基因拷贝数,2020/7/26 吉林农业大学,69,检测病原物种类的办法,找到某种病原物的特异性核酸序列， 对待检病原的核酸进行该序列的PCR扩增。 扩增结果阳

33、性，表示待检病原为特定病原物； 扩增结果阴性，表示待检病原非特定病原物。,2020/7/26 吉林农业大学,70,1.检测病原物的种类,王杰等（2005）建立了能直接以大豆干种子为检测对象的SMV 快速、灵敏、特异的RT-PCR检测技术，从而为防治大豆花叶病提供了关键技术。 Jansen 等在检测ToMV (Tomato mosaic virus)和TMV(Tobacco mosaic virus)的过程中，发现这两种病毒的抗血清交互反应，ELISA 不能区分出这两种不同的血清型。 但应用IC-RT-PCR 时，只要病毒浓度在10100 fg/mL之间， TMV 或者ToMV 就能被检测到，能

34、扩增出各自的分离物。,2020/7/26 吉林农业大学,71,检测病原物的种类,Korimbocus 等报道，利用实时荧光PCR 检测到侵染甘蔗的ScYLV(Sugarcane Yellow leaf virus), 其灵敏度是常规PCR 的100 倍， 能从反转录PCR，ELISA等方法检测不到ScYLV的样本中检测到该病毒。 Murray 等报道，多重免疫捕捉反转录PCR能够同时检测和区分出侵染香蕉的BBTV、BBrMV 、 CMV 等3种病毒。 Bertolini 等报道了用多重反转录PCR 能同时检测到侵染橄榄树的CMV等6种RNA病毒。,2020/7/26 吉林农业大学,72,2.检

35、测病原物的数量,目前，实时荧光PCR方法被评价为检测土壤等样品中微生物种类和数量的最有效方法。,2020/7/26 吉林农业大学,73,3. 分析转基因植物外源基因拷贝数,杨立桃等（2005）利用实时荧光定量PCR 方法分析转基因水稻外源基因拷贝数，3 个植株定量PCR 分析的转基因拷贝数稍高于Southern Blot 的分析结果。 主要原因是Southern Blot 方法在同一个插入位点有多拷贝的T - DNA 片段插入时,转基因植株的基因组在完全酶切时会产生相似的DNA片段,电泳分析时很难分辨清楚。 定量PCR 方法则完全避免了这种情况的发生,除非目的基因DNA 片段在PCR 引物处发

36、生断裂。两种方法分析结果的比较显示定量PCR 方法分析转基因拷贝数更加有效、适用。,2020/7/26 吉林农业大学,74,二. RAPD方法 与 SCAR标记,（一）RAPD方法的基本原理 （二）SCAR标记 （三）RAPD技术 及 SCAR标记 在植物病理学中的应用,二. RAPD方法 与 SCAR标记,RAPD，即随机扩增多态性DNA (Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD) 是由美国杜邦公司的Williams(1990)和加利福尼亚生物研究所Welsh两个小组在PCR技术基础上，发展起来的简便快速的检测DNA多态性的方法。 此技术对基因组的DNA全

37、部进行PCR扩增，以检测多态性。由于整个基因组存在众多反向重复序列，单一随机引物与反向重复序列结合,使重复序列之间的区域得以扩增。 由于该方法可在缺乏任何分子生物学研究背景的物种上应用（构建基因组指纹图谱、阐明物种亲缘关系等），且研究费用低廉，表现出独特的优势，获得了广泛应用。,由于PCR方法只能对已经了解了基因序列的情况下才能使用，就极大的限制了其应用范围。 为在缺乏任何分子生物学研究背景的物种上应用（检测、鉴定病原物、阐明物种亲缘关系等），就产生了RAPD方法。,2020/7/26 吉林农业大学,76,RAPD方法的缺点,在RAPD方法获得广泛应用的同时， 也发现了该方法的最重要的缺点 标

38、记检测结果的不稳定性。 N. F. Weeden等人的研究表明，RAPD标记检测误差在5%10%之间。 Paran和Michelmore(1993)提出的SCAR标记技术可以解决这一问题。,（一）RAPD方法的基本原理,RAPD标记技术就是用一个（有时用两个）随机引物（一般810个碱基）非定点地扩增基因组DNA，然后用凝胶电泳分开扩增片段。 模板DNA经9294 变性解链, 在足够低的温度下(3537,一般低于40)与单个随机引物(一般为10个碱基)退火,如果互补的两条DNA链上的2个退火位点足够接近(约2002000bp),通过延伸便可扩增出DNA片段。 整个基因组存在众多反向重复序列，单一

39、引物与反向重复序列结合,就会使重复序列之间的区域得以扩增。 如此30次PCR循环也将产生上百万倍的扩增产物。,2002000bp,反向重复序列,反向重复序列,2020/7/26 吉林农业大学,78,RAPD方法的基本原理,对于特定引物， 不同生物类群的基因组DNA退火位点总有不同, 能否扩增以及扩增产物的种类、长度就有所不同。 可用电泳检测使用特定引物时DNA能否扩增及扩增片断的（种类）长度的多态性图谱。,不同物种，产生的多态性不同。 故，可用此方法检测、鉴定病原物（扩增产物完全一样，则两者为相同生物） ； 研究不同病原物的亲缘关系（扩增产物越相似，亲缘关系越近）。,0.2kb,0.5kb,0

40、.3kb,0.2kb,0.5kb,0.3kb,0.2kb,0.3kb,0.5kb,品系1 品系2,2020/7/26 吉林农业大学,80,通常采用30个以上的随机引物扩增来筛选出若干可有效扩增的引物,通常采用30个以上的随机引物，进行30次以上的扩增, 就可获得一组目标基因组DNA多态性的实验数据。 同一生物类群具有相似的遗传背景，扩增获得的DNA多态性的实验数据也是相似的； 对不同生物类群来说，获得的DNA多态性的实验数据也不相同。 通过对目标基因组DNA进行RAPD扩增获得的DNA多态性实验数据用统计方法处理后（如进行聚类分析，以树状聚类图方式表达等），则可以得到相应的DNA遗传、分类、进

41、化等更多信息。,2020/7/26 吉林农业大学,81,RAPD分析技术实验流程,RAPD分析技术实验流程包括: (1) 模板DNA的提取纯化； (2) 用随机引物进行DNA扩增 （不少于30个随机引物）； (3) 扩增产物的检测； (4) 用统计方法处理。,烟草野火病抗性基因的RAPD分析,徐秀红采用了423条随机引物对抗病亲本Ky14和感病亲本Speight G-140进行RAPD分析，其中9条引物能在抗、感亲本间稳定扩增出有差异的条带。 9条引物在抗、感亲本间的扩增差异见图。,2020/7/26 吉林农业大学,83,烟草野火病抗性基因的RAPD分析,将以上9条引物在抗、感基因池间进行扩增

42、检测，结果只有引物S52在抗、感基因池间显示出多态性差异，6次重复扩增，结果稳定。S52产生的差异片断约2 000 bp，记作标记S522000。 S52在抗、感基因池间的扩增结果见图。 初步推断，该标记与来自N.longiflora的烟草野火病抗性基因存在连锁。,一族群中所有基因的集合为基因池（gene pool） 抗病基因池： 多个抗病品种DNA的混合物。 感病基因池： 多个感病品种DNA的混合物。,1.3000,1.1975,0.8950,0.7776,0.7066,0.6179,0.8299,0.6795,0.5731,0 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2

43、 1.3,QY E3 GX E1 BE EB E4 A B HU,根据RAPD分析 绘制出的10个 生物群体的聚类图,2020/7/26 吉林农业大学,85,（二）SCAR标记,为解决RAPD标记的不稳定性问题， Paran和Michelmore(1993) 提出了序列特异性扩增区技术（sequence characterized amplified region，SCAR）。 与RAPD 标记法相比，SCAR标记PCR 反应条件严谨、结果稳定、重复性强，在应用上具有快速、简便、低成本的特点，已成为多种分子标记中的首选标记。,SCAR标记原理,该技术是通过对RAPD扩增产物测序的基础上，设计一

44、对新的引物特异地扩增原引物可扩增的DNA片段。 一对新的引物： 分别在原RAPD引物的3与5端各延长1014个碱基。 延长后的每个引物为1824个碱基。 除将引物加以改变以外，还应将PCR 扩增条件加以适当调整：退火温度为6066 、MgCl2 浓度常为1.5 mmol/L 。,2020/7/26 吉林农业大学,87,（三）RAPD技术 及 SCAR标记 在植物病理学中的应用,1. 鉴定病原物的种类 2. 研究某些病原菌类群间的亲缘关系 3. 进行抗病基因的标记定位,2020/7/26 吉林农业大学,88,1. 鉴定病原物的种类,区别形态相似的病原物： 特定引物扩增可在某病原物中获得特定的DN

45、A谱带，而在另一病原物中无此带出现，此特异片段就是一种鉴定标记。 于拴仓等（2005）利用RAPD 技术筛选了4 个引物，可以将番茄叶霉病菌生理3 个生理小种完全区分开来。 康振生等（2005）用210 条随机引物对中国小麦条锈菌(Puccinia striiformis f. sp. tritici) 5个主要生理小种进行了RAPD 分析, 获得了条中29 号小种专化的SCAR 标记。 曹丽华等建立了小麦条锈菌条中31 号小种SCAR 检测标记。,2020/7/26 吉林农业大学,89,2. 研究某些病原菌类群间的亲缘关系,利用30个以上随机引物的（特定）扩增条带的有无（1，0），进行聚类分

46、析，研究不同病原物的亲缘关系（扩增产物越相似，亲缘关系越近）。 吴小芹等（2005）对来自日本、韩国、美国、加拿大和中国大陆6 省及台湾地区的松材线虫和拟松材线虫16 个虫株的基因组DNA 进行RAPD 分析，结果显示,松材线虫和拟松材线虫明显分为两大类。 在松材线虫群体中,又可分为3 个亚组: 中国大陆虫株与日本虫株为一亚组,加拿大虫株为一亚组,中国台湾虫株与美国虫株为一亚组。 拟松材线虫群体亦可分为两亚组: 一为日本、中国台湾和中国江苏虫株, 二为韩国和中国湖南虫株。,2020/7/26 吉林农业大学,90,3.进行抗病基因的标记定位,如利用多个抗病、感病品种进行RAPD扩增， 也可望找到

47、抗病、感病品种有差异的扩增带， 则抗病品种共有的带上即存在抗病基因。 张志永等(1998) 对30 个栽培大豆品种进行了RAPD指纹图谱分析。 结果表明： 较短的片段S 5600 和S 05660 是抗病品种的特征性条带; 而较长片段S 51000 和S 51600 是感病品种的特征性条带。,2020/7/26 吉林农业大学,91,三. RFLP 和 AFLP技术,（一）RFLP的基本原理 （二）AFLP的基本原理,三. RFLP 和 AFLP技术,限制性片段长度多态性 （Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP） 是Bostein和White

48、等人于1980年首次提出的分子标记技术。 RFLP技术的优越性在于稳定性好、可靠。 但此法费用高，周期长，多态性水平低，限制了这种技术的应用。 扩增片段长度多态性 （Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP） 是由荷兰科学家M. Zabeau和P. Vos于1993年提出的分子标记技术。 AFLP结合了RFLP的稳定性和PCR 技术的高效性，它无需基因组DNA的背景资料即可完成模板DNA多态性的检测，可产生丰富而稳定的遗传标记,被认为是一种高效的分子标记技术。,2020/7/26 吉林农业大学,93,（一）RFLP的基本原理,生物不同类群的DNA序

49、列中，总会存在许多不同的限制性内切酶识别位点。因而，当某一特定的限制性酶切割DNA时，就会产生酶切DNA片段长度的差异。 这种差异可反映在电泳图谱上。检测出的特异带型是鉴别物种、分析类群间类缘关系等的科学依据。 对于每一个DNA基因组/限制性内切酶组合来说，所产生的片段长度多态性是特异性的，故RFLP被称为DNA指纹。,2020/7/26 吉林农业大学,94,DNA提取 用DNA限制性内切酶消化 凝胶电泳分离限制性片段 将这些片段按原来的顺序和位置转移到易操作的滤膜上 用放射性同位素或非放射性物质标记的DNA作探针与膜上的DNA杂交（称 Southern杂交） 放射性自显影或酶学检测显示出不同

50、材料对该探针的限制性酶切片段多态性。,RFLP的基本步骤,用限制性酶来酶解高等生物核DNA会产生数万个片段，其大小变化是连续的，如进行电泳分离，只能看到弥散状的连成一片的电泳结果。然而，各限制片段在凝胶中还是分开的，但不能分辨。 进行Southern印迹转移操作，用特定的探针与滤膜上的DNA杂交，经过放射自显影就能检测到高等生物核DNA的RFLP。,2020/7/26 吉林农业大学,95,酶切，电泳后（转膜杂交自显影）检测结果,较大片段,RFLP标记技术的基本手段就是通过电泳的方法分离这些片段。 转膜、杂交、自显影后检测结果,较小片段,2020/7/26 吉林农业大学,96,（二） AFLP的基本原理,植物基因组DNA经限制性内切酶消化形成相对分子量