课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 (7)

1、课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,一、课题背景,1、尿素的利用,尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。,2、细菌能利用尿素的原因,土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶,3、常见的分解尿素的微生物,芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。,4、课题目的,从土壤中分离出能够分解尿素的细菌,统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌,一.研究思路,.筛选菌株,.统计菌落数目,.设置对照,1、实例： PCR技术,DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制(PCR)的技术

2、，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。,.筛选菌株,耐高温的酶存在于哪里？,美国黄石国家公园的一个热泉中,水生耐热细菌Taq中,Taq细菌在哪发现的？,原因：因为热泉温度70800C，淘汰了绝大多数微生物只有Taq细菌生存下来即被筛选出来。,为什么Taq细菌能从热泉中被筛选出来呢？,而实验室中微生物的筛选也应用了同样的原理,自然界中目的菌株筛选的依据： 根据目的菌株对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。,方法： 抑制大多数微生物的生长 促进目的菌株的生长 结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。,2、实验室中微生物的筛选原理：,人为提供有利

3、于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。,3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：,从物理性质看此培养基属于哪类？,固体培养基,在此培养基中哪些作为碳源、氮源？,碳源：葡萄糖 氮源：尿素,该培养基的配方中尿素是唯一的氮源，只有能够合成脲酶的微生物才能利用尿素，才能在该培养基上生长。其他的微生物由于缺乏脲酶不能分解尿素，从而缺乏氮源不能在培养基上生长繁殖，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。,4、培养基选择分解尿素的微生物的原理,选择培养基： 在微生物学中，允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。,.统计菌落数目：

4、 1.显微镜直接计数法：这种方法是利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。,缺点,不能区分死菌与活菌；(台酚蓝正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内；而丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色。) 不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察；,计算公式：,每克样品中的菌株数 =（CV）M,某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得 平板上菌落数的平均数为234，那么每克样 品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液 的体积为0.1ml） ( ) A. 2.34108 B. 2.

5、34109 C. 234 D. 23.4,2.间接计数法(活菌计数法)： 常用方法：稀释涂布平板法。 原理：在稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。（1个菌落1个活菌） 注意事项,每克样品中的菌落数(CV)M 其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。,注意事项 为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板上进行计数。 为使结果接近真实值每个稀释度取3个平板，经涂布，培养计算出菌落平均数。 统计的菌落往往比活菌的实际数目低。这是因为

6、两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。,例：两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。 1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。 2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。 你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？,甲：第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组， （至少涂布3个平板），因此结果不具有说服力。 乙：第二位同学考虑到设置重复组的问

7、题，涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与另2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。,?,说明设置重复组的重要性。这个实例的启示：在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。,.设置对照： 对照实验是指除了被测试条件以外，其他条件都相同的实验，其作用是比照实验组，排除任何其他可能原因的干扰，证明确实是所测试和条件引起相应的结果。设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果

8、的可信度。,P22旁栏思考题 想一想，如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？ 答：统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板菌落数的平均值，然后按课本旁栏的公式进行计算。,思考,A同学的结果与其他同学不同，可能的解释：,（1）土样不同（2）由于培养基污染或操作失误。(或者是混入了其他的含氮物质),请通过设置对照，帮助A同学排除上述两个可能影响实验结果的因素。,阅读课本P2223小字部分,小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。,方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验,方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空

9、白对照，以证明培养基是否受到污染。,结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。,（二）统计菌落数目： 活体计数法 （1）操作方法： 稀释涂布平板统计菌落数 （2）原理： 1个菌落1个活菌 （3）统计原则 选 30300 个菌落的平板统计 每个稀释度取3个平板取其平均值,为什么？,1、实验设计的内容包括 , . 2、 观察图示27理解后思考实验流程。 实验流程： 3、土壤有“微生物的天然培养基”之称。土壤微生物主要分布在距地表 的近 的潮湿土壤中，约 为细菌。,二、实验设计：,实验方案、所需仪器、材料、用具和药品,具体的实施步骤以及

10、时间的安排,配制土壤溶液，制备培养基，系列稀释，涂布平板与培养，菌落计数,38cm,中性,7090,.土壤取样 （1）取样的位置： 土壤，微生物的天然培养基，含有大量的微生物，其中7090是细菌。细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，在富含有机质的土壤层的38cm处中分布着绝大多数的细菌。 （2）取样要求：先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。应在火焰旁称取土壤10g。 取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。,准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基

11、可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。,.制备培养基：,（三）样品的稀释,应在火焰旁称取土壤10g。将称好的土样倒入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，塞好棉塞。依次等比稀释至106稀释度 在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行。,分离不同的微生物采用不同的稀释度，其原因是 ，其目的是保证获得 的平板。 细菌稀释度一般为 ， 放线菌稀释度为 ， 真菌稀释度为 。,不同微生物在土壤中含量不同,菌落数在30300之间、适于计数,104、105、106,103 、 104、105,102、103、104,为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解

12、尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？,答：这是因为土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2 185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。,思考题,.取样涂布,实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。,选取适合的稀释范围分别吸取0.1 mL进行平板涂布操作。如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相

13、差较大，表明试验不精确，需要重新实验。,.微生物的培养与观察,在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。 选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。,培养不同微生物往往需要不同培养温度。 细菌：3037培养12d 放线菌：2528培养57d 霉菌：2528的温度下培养34d。,将涂布好的培养皿放在30 温度下培养。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生。 比较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。,在一定的培养条件下（相同的培养基、温度及培养时间），同种微生物表现出相同而稳定的菌落特征。这些特征包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等方面,关

14、注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。,关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。,关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。,关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。,大肠杆菌呈 黑色中心 ,有或无金属光泽,大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征,思考在研究未知微生物时务必规范操作，以防被 感染，实验后一定要洗手。,致病微生物,三、操作提示,阅读P25页,1、无菌操作 2、做好标记 3、规划时间,按浓度捆成一摞,恒温37培养,四.结果分析与评价 1.通过对照

15、实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。 2.提示：选择每个平板上长有30300个菌落的稀释倍数计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。,五.课外延伸,在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。,五 课题延伸,怎样对分离的菌种作进一步的鉴定?,2. 怎样判断细菌分解尿素的化学反应是否发生？,3. 怎样鉴定某细菌能够分解尿素？,借助生物化学的方法,通过检测培养基pH变化来判断,在以尿素为唯一氮源

16、的培养基中加入酚红 指示剂。培养某种细菌后，如果pH升高，指 示剂将变红 ，说明该细菌能够分解尿素。,本课题知识小结:,1.对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（ ） A.在液体培养基上进行 B.至少接种一种细菌 C.接种一个细菌 D.及时补充消耗的营养物质 2.使用选择培养基的目的是（ ） A.培养细菌 B.培养真菌 C.使需要的微生物大量繁殖 D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别 3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是( ) A.CO2和N2 B.葡萄糖和NH3 C.CO2和尿素 D.葡萄糖和尿素,实践训练,A,C,D,4.下列说法不正确的是（ ） A.科学家从7080度

17、热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶 B.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数的估计值 C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度 D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。 5.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（） A.较多的氮源物质 B.较多的碳源物质 C.青霉素类药物 D.高浓度食盐,B,C,6.下列说法不正确的是（ ） A.科学家从7080度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶 B.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5，以

18、M3作为该样品菌落数的估计值 C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度 D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。,B,六、例题解析,例1对细菌群体生长规律测定的正确的表述是 A在液体培养基上进行 B至少接种一种细菌 C接种一个细菌 D及时补充消耗的营养物质,解析：细菌群体生长规律的测定是人们在一定条件下进行的。这些条件是：一种细菌、恒定容积的培养基，液体培养基、定时测定细菌总数。在这些条件下，才能测定出细菌的生长规律。测定时只能用一种细菌的子细胞群体的变化规律表达微生物的生长；恒定容积是给微生物提供一定的生存环境；液体培养基才能通过样品推测细菌总数。若接种多种细菌，则会发生种间斗争而不能测定一种微生物的生长规律。在接种时，要保证一定的接种量。,答案