1(1).实验一.ppt

1、分子生物学中其他常用的实验仪器。恒温振荡器2。清洁工作台3。高压釜4。高速台式离心机5。微型液体提取器，实验1。聚合酶链反应扩增脱氧核糖核酸片段实验目的实验原则实验仪器、材料和试剂实验步骤实验结果及讨论实验目的掌握聚合酶链反应的原理和技术原理。聚合酶链式反应是一种体外扩增特定基因片段的技术。通过聚合酶链反应技术可以在短时间内获得数百万份特定的脱氧核糖核酸序列；聚合酶链反应技术已广泛应用于基因疾病的分子克隆和基因诊断。聚合酶链反应技术实际上是一种酶促合成反应，依赖于模板脱氧核糖核酸、引物和四个脱氧核苷酸存在下的脱氧核糖核酸聚合酶。聚合酶链反应技术的特异性取决于引物和模板结合的特异性。聚合酶链反应

2、：变性退火延伸，聚合酶链反应，反应分为三个步骤：变性：在高温条件下，脱氧核糖核酸双链解离形成单链脱氧核糖核酸；退火：当温度突然下降时，引物和它的互补模板局部形成杂交链；延伸：在脱氧核糖核酸聚合酶、脱氧核糖核酸聚合酶和Mg2的存在下，聚合酶催化以引物为起点的脱氧核糖核酸链延伸反应。以上三个步骤是一个周期，每个周期的产品可以作为下一个周期的模板。经过几十个循环后，两个引物之间的特异性DNA片段被大量复制，数量达到106-107个拷贝。聚合酶链反应技术有七个主要参数：聚合酶、引物、脱氧核糖核酸、反应缓冲液、二价离子、模板和一价离子。3。实验仪器、材料和试剂(1)仪器1。聚合酶链反应仪器。台式离心机3

3、。微型液体提取器4。紫外荧光观察仪器5。高压灭菌微型离心管6。脱氧核糖核酸扩增系统。琼脂糖凝胶电泳系统。(2)将材料模板DNA : 800bp的片段插入PeSy-T1载体(或pMD18-T或KS载体)(3)试剂1.10聚合酶链反应缓冲液2.2。Taq酶：5u/l 4 .引物1和2 (m13f，m13r): 2mol/l，pMD18-T Vector，4 .实验步骤1。在0.2毫升Eppendorf管中制备25升反应体系：DDH2O:18.25升(25-6.75) 7 10聚合酶链反应缓冲液：2.5升7脱氧核糖核酸(2.5毫米4)2L 7 M13-F(10米):0.5升7 M13-R(10米):

4、0.5升7 Taq酶：0.25升7模板：1L/管注：制作阴性对照管，即模板用双蒸水灭菌，2。按照以下循环程序进行945(3)分钟的扩增，一个循环；94 30秒、58 30秒、72 1分25秒；30个周期；72块10分钟。4保温。3.扩增后，将所有的聚合酶链反应产物进行1%琼脂糖电泳以检测扩增并分析结果。在紫外灯下将扩增后的琼脂糖凝胶块中的DNA片段切割，放入埃本多夫管中。4储存在冰箱中进行回收。5.实验结果和讨论在聚合酶链反应系统的调节过程中，应尽可能减少污染的机会，以避免目标带以外的杂带的出现。如果退火温度太低，还可能出现杂散带。1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 M

5、，用3 mg DNA Marker DL2，000(500 ng/条带)进行1%琼脂糖凝胶电泳后，DNA条带从上到下分别为2kb、1Kb、750bp、500bp、250bp和100bp。注意事项聚合酶链反应是在没有脱氧核糖核酸污染的清洁环境中进行的。一般来说，只要能获得可靠的结果，模板纯化方法越简单越好。要使用新制备的或正确储存的未使用的试剂或缓冲液提取核酸，不要使用以前用于其他样品的试剂。所用的所有溶液应无核酸和核酸酶污染。手套最适合用于制备试剂、操作样品、建立反应和检测未来的扩增产物。所有聚合酶链反应试剂中使用的水应使用新鲜蒸馏去离子水高压灭菌，然后单独包装以备后用。所有试剂都应大量制备，

6、测试它们是否令人满意，然后将它们分成小部分以确保实验之间的连续性。所有试剂或样品应使用一次性无菌塑料瓶和离心管制备，玻璃器皿应清洗干净并高压灭菌。聚合酶链反应样品应在冰浴中融化并充分混合。应设计无模板的阴性对照进行扩增反应，并应加入标准的脱氧核糖核酸分子量标记进行电泳以估计产物大小。琼脂糖凝胶电泳检测DNA分子主要是在凝胶中加入溴化乙锭，使溴化乙锭分子嵌入DNA分子形成复合物，使DNA在紫外光下发出强荧光，而DNA在紫外光下发出的荧光是可见光。当溴化乙锭充足时，荧光强度与脱氧核糖核酸的含量成正比，因此检测脱氧核糖核酸是方便的。例如，通过使用已知大小和浓度的标记作为电泳对照，可以估计待测样品的大

7、小和浓度。1.琼脂糖2。TAE电泳缓冲液(50): Tris 242g，冰醋酸57.1ml，0.5mol/l乙二胺四乙酸(ph8.0) 100ml。稀释至电泳缓冲液1TAE溴化乙锭溶液10毫克/毫升，室温下保存在棕色瓶中或铝铂纸上。4.10 (6)溴酚蓝指示剂(DNA样品装载缓冲液)，1TAE制备1% Agrose琼脂糖凝胶溶液并加热至琼脂糖完全溶解；Agrose琼脂糖凝胶溶液稍凉(约60)后，加入约1/1000 1毫克/毫升溴化乙锭溶液(最终浓度为0.5-1克/毫升)，然后轻轻搅拌，不要有气泡(避免剧烈摇动产生气泡)；当溶液冷却到约50-55(不热)时，将其倒入电泳槽中，迅速将梳子插入制胶槽

8、的一端，并检查是否有气泡。电泳结果在紫外观察器上观察；根据需要，切断DNA带，将其放入1.5毫升离心管中，并将其放入4 (-20)中进行冷冻保存，以备将来实验。附件：引物设计原则寡核苷酸引物长度一般为1530bp。石墨含量石墨含量一般为40%-60%。碱基的随机分布：碱基在引物中的分布应该是随机的，不应该有聚嘌呤或聚嘧啶。引物本身：引物本身不应该有互补序列，否则引物本身折叠成发夹结构或引物本身复性。由于空间位阻，该二级结构将影响引物和模板的复性。引物之间：两个引物之间不应有互补性，特别是要避免三个末端的互补重叠，以防止引物二聚体的形成。引物的3个末端：引物的延伸从3个末端开始，不能被修饰。引物的5-末端：引物的5-末端决定了聚合酶链反应产物的长度，对扩增特异性影响很小。因此，它可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5末端的修饰包括：添加酶切位点；标记生物素、荧光等。引入蛋白质结合位点；突变位点的引入、突变序列的插入和缺失以及启动子序列的引入等。密码子简并性：如果编码区被扩增，不要在引物的第三个位置终止，因为第三个位置容易简并，这会影响扩增的特异性