免疫印迹法.ppt

1、免疫印迹法(immunobiotting test，IBT)也是酶联合免疫转移点法(enzyme linked immuno eletrotransfer blot，EITB)，将页面分离蛋白样品转移到固相载体(如硝酸纤维素薄膜)的固相载体可以通过非共价键吸附蛋白质，保持电泳分离的多肽类型和生物活性。以固相载体中的蛋白质或多肽作为抗原，引起相应抗体和免疫反应，与用酶或同位素标记的第二抗体反应，通过基质发色或放射性显影检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白质成分。(约翰f肯尼迪，Northern Exposure美国电视剧，健康)，原理，程序，免疫压印法1，SDS-聚丙烯腈电泳(SDS-PAGE

2、) 2，电传3这样蛋白质的迁移率取决于分子量的大小。基本步骤，1，蛋白质样品的制备，IPTG刘涛细菌在适当的分解液中分解，根据目的获得常青和沉淀，然后与蛋白质Loading Buffer一起在沸水中作用10分钟，获得蛋白质样品。第二，凝胶的制备1。制胶机的安装2。分离胶的配方：根据蛋白质的大小，根据配方，配制适当浓度的分离剂，放入制胶机，用超纯水棒保证分离胶的液面平坦。3.浓缩液的赵霁：分离胶完全变硬后，倒入超纯水，根据配方加入浓缩液，加入样品梳子。3.电泳静压60V电泳可以在1小时左右后将电压提高到80V，再运行2小时左右。2，电转录(半干转换法)，电人膜顺序：双层滤纸-NC膜-SDS-页面

3、粘合剂-双层滤纸从波到玻璃棒顺利排出的气泡。滤纸，凝胶，NC膜，电涡流大小和时间：恒流=0.8 mA/cm2电泳，2小时前转录结果检查：电泳结束后用利春红预染色NC膜，观察转移效果。然后用水冲洗李春红的颜色，将其关闭。滤纸，3，酶免疫位置，关闭：从上面获得的NC膜作为封闭液在摇床上过夜。为了防止免疫试剂的非特异性吸附。清洁：关闭时间一到，用PBST清洗NC膜3次左右，每次约15分钟。一元孵化：洗后加入一元标记2小时左右。一般的选择来自兔子或老鼠。清洁：孵化后再用PBST清洗3次左右，每次约15分钟。消除未结合的一元制。2段孵化：洗净后加入2段标记1小时左右。二项式根据一项的来源，选择适当的双项

4、式兔子或双项式老鼠。清洁：做2项标记后，用PBST冲洗3次左右。一次约15分钟。消除非特异性结合的二项式。发色，辣根过氧多酶相关发色法原理：第2段上面有辣味根过氧多酶HRP，它使发色基质发色，发光组发光，达到发色目的。常用的HRP显色方法为1 .气质显色法(DAB显色法)2。化学发光显色法(ECL显色法)、显色法、放射性核素检查、辣根过氧化物酶相关显色法、碱性磷酸酶法、特点：33二氨基苯甲氨酸反应速度快、灵敏度高、特异性好。但是颜色显示后，如果光线褪色几个小时，就很难保存。，1 .底物发色法(DAB发色法)，DAB发色液的配方：0.01mol/L Tris-Cl(pH7.6) 1ml的0.3% CoCl2 DAB的10ul的H2O2，特征灵敏度高，安全。2 .化学发光颜色法(ECL法)，准备发光基质：2ml A液2ml B液6ml SW。摇床和NC膜避开光，孵化5分钟。SDS-page电-永冻分离蛋白膜通宵关闭的PBST洗涤3