RNAi研究进展

1、RNA干扰研究进展RNA干扰（RNA interference，RNAi）现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制，是指内源性或外源性与靶基因的转录产物mRNA存在同源互补序列的双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)在细胞内特异地降解该mRNA，从而致使特异性的基因有效封闭的过程，是一种序列特异性的转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)。RNAi现象已在不同种属的生物体中发现，下面对RNAi的作用机制、作用特点、生物学意义和应用等的最新研究进展作一综述。1. RNAi的作用机制与特点1.1 R

2、NAi发生的分子机制 RNAi的详细机制和过程还不十分清楚，目前大致分为以下几个阶段进行：siRNA的形成阶段：此阶段需要Rde-1,Rde-4和dsRNA特异性的核酸内切酶Dicer等共同参与。Rde-1,4编码的蛋白识别外源dsRNA，引导dsRNA与Dicer结合，然后，Dicer将dsRNA解旋，再将其裂解为21-25 nt大小的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）。Dicer定位于胞浆中，但核内mRNA剪切修饰后在向核外运输过程中也存在RNAi现象，可能有其他类似功能的酶发挥作用。现认为21-25nt大小并在3端带有2-3个碱基悬端且5端磷酸化的si

3、RNA诱导的RNAi效应最强。Dicer家族在进化上非常保守，有5个组成部分：N-端RNA解旋酶结构域、1个PAZ结构域(Piwi，augonaute，Zwille/pinehead，PAZ)、2个 RNaseIII结构域和C端dsRNA结合基序。Dicer在体内一般是以二聚体的形式发挥作用的，由于不同种族Dicer分子大小不一样，所以dsRNA被切割成的siRNA大小具有种族差异。 RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silicencing complex，RISC）形成阶段：生成的siRNA和RNAi特异性酶如AGO-2、MUT-7、RED-1、PAZ蛋白和DNA-RNA螺旋酶

4、结合形成RISC，具有序列特异性核酸内切酶、核酸外切酶和解旋酶活性，能特异地降解与siRNA同源的靶mRNA。效应阶段： siRNA引导RISC与同源性的mRNA结合，在ATP及解旋酶（如qde-3，mut-6，mut-14）的作用下使siRNA链解离，并使RISC由250kD大小的前体形式变成约100kD左右活性形式，同时解旋酶催化同源mRNA与siRNA的正义链相互交换，核酸酶在mRNA与反义RNA所形成的双链区的5起始端下游7-10个核苷酸处切断mRNA，起到特异的抑制基因表达的效果。扩增阶段：该反应以siRNA中的一条链为引物，以靶mRNA为摸板，在RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-d

5、ependent RNA polymerase，RdRP)作用下，扩增靶mRNA，产生新的二级siRNA，而这些siRNA又能继续反作用于靶mRNA。RdRP不仅能增加siRNA的拷贝数，而且能将异常的单链RNA转变dsRNA。RdRP还是一个重要的“sensor”，它能识别正常和异常的RNA。转基因RNA和病毒RNA都是在RdRP的识别下启动RNAi的反应过程。此外，RNAi的扩增效应还可能存在另外两种机制：Dicer将长dsRNA切成初级siRNA ，这一放大水平取决于dsRNA的长度；siRNA在酶的作用下可以多次应用，产生进一步的放大效应。1.2 RNAi的特点高度特异性：有时siRN

6、A一个碱基改变就会大大降低封闭靶基因的效果。Brummelkamp等利用载体表达的小发夹RNA （small hairpin RNA，shRNA）来封闭人MCF-7细胞的CDH1基因，shRNA上仅一对碱基的突变就不能抑制CDH1基因的表达。其中siRNA的中央位置碱基位点和3末端倒数第二个碱基起了格外重要的作用。高效率：在细胞内RNAi途径一旦被启动，反应信号就被放大。在低等动物中靶基因表达抑制效率大于90%，甚至有人认为每个细胞一份拷贝的dsRNA就可以封闭基因的效果。高成功率：RNAi已被用于线虫全基因组的功能分析，其中有50%-80%序列选择有效，12.9%-27%的基因封闭产生了明显

7、的异常表型。种属时-效性：Irie等人发现，在低等生物中RNAi可持续存在，但RNAi在哺乳动物细胞中只能维持一段时间，一般注入dsRNA后的2-3天，RNAi的作用最明显，尔后1-2天内，靶mRNA的丰度就能恢复到注射RNAi之前的水平。这可能是由于RNA依赖的核苷脱氨酶脱氨基活性的逐步增高导致siRNA的生成减少而受到抑制。dsRNA的长度限制性：引发有效RNAi的dsRNA最短不得短于21nt，Dicer能与200-500nt范围内的dsRNA结合，底物片段越短，Dicer酶的活性也就越弱，提示RNAi具有dsRNA片段长度限制性。RNAi的遗传性：1998年Fire等就发现在线虫中RN

8、Ai可以传代，以后Worby等人在果蝇的培养细胞中也发现了类似的现象。线虫中的RNAi遗传性需要de-1和de-2来启动。传播性：RNAi效应可以在细胞间扩散，dsRNA可在果蝇细胞群落之间传播，在线虫局部注射dsRNA也可传播到整个机体。最近Van等研究发现sid-1基因编码一种具有十一次跨膜蛋白可能与此现象有关。ATP依赖性：在去除ATP的样品中RNAi现象降低或消失，显示RNAi是一个ATP依赖的过程，可能与Dicer和RISC的酶切反应必须由ATP提供能量有关。模板选择性：RNAi只有效作用于外显子，而对内含子无影响。dsRNA序列是某个基因的启动子序列时也没有明显的效应。另外，RNA

9、i 对稳定并丰富表达的靶基因抑制效率也不高。2 RNAi的生物学意义 RNAi的生物学意义主要是维持基因组稳定、抑制转基因表达和保护基因组免受外源核酸侵入。研究证实RNAi缺陷可引起内源性转座子的移动。最近研究表明，转座子沉默与DNA甲基化、H3mK9(histone H3 lysine-9 methylation)和RNAi有关，大多数转座子沉默与met1(DNA methyltransferase)、ddm1(decrease in DNA methylation 1)和sil1(Streptomyces subtilisin inhibitor-like 1)有关，而很少的转座子沉默需要

10、KRYPTONINE（H3K9 methyltransferase）、ARGONAUTE1（RNAi gene）和CHROMOMETHYLASE3（CXG methyltrasferase）。Hall等研究表明，着丝粒同源重复序列和RNAi组分一起正负调节着异染色质的形成并且共同促使异染色质组装成核。最近研究发现，RNAi需要的一种 AGO蛋白TbAGO2与细胞有丝分裂和染色体分离有关。dsRNA还出现在许多病毒（包括单链RNA病毒）感染的细胞内，诱发RNAi而封闭病毒生存和繁殖所必需的基因或激发干扰素诱导的抗病毒效应。RNAi还可能在胚胎发育过程中具有重要功能，也可能参与了生物体正常的基因表

11、达调控，同时与基因印迹也有关。3 RNAi技术RNAi技术是利用RNAi为原理，在体外利用化学或酶促合成siRNA，也可构建在体内合成siRNA的质粒或病毒表达载体，然后利用传统微注射磷酸钙法、电穿孔转染法、脂质体介导转染等方法转染细胞从而致使靶基因沉默的技术。RNA干扰有很多方法：化学合成法：应用最广泛但成本昂贵，体外合成的长21nt、3端带有2个游离核苷酸的siRNA较其它形式合成的RNA具有更大效率的降解目的mRNA的效果。 siRNA表达载体：在质粒或病毒载体中，利用RNA聚合酶启动因子U6或T7分别控制正义链和反义链的合成并退火形成双链siRNA，或在启动子下游设计带发夹结构的表达单

12、位，自身退火形成双链siRNA。dsRNA表达载体：多用于果蝇、线虫等低等生物，在体内表达后被Dicer切割成21-23nt的siRNA；或在体外利用Dicer、RNaseIII切割dsRNA产生siRNA，纯化后使用。4 RNA技术的应用RNAi作为一种简单快速、特异、高效、经济、效果可预测的技术，具有明显的优点，它比反义核酸技术优越，比基因敲除简单，具有很好的应用前景。具体可用于以下几个方面：4.1 基因功能分析 基因敲除技术需要较长时间去永久性的关闭某个基因的表达，而RNAi技术则可在一周内、甚至2天内可控性的关闭10个基因。RNAi技术还具有一个优势，能同时封闭多个基因或基因家族，用于

13、研究mRNA差别剪接形成的异构体，甚至在基因组水平上构建针对基因组的RNAi表达载体，用于研究基因之间的相互作用和进行基因功能的高通量筛查。使用RNAi技术在那些低等生物中基因组功能测定都已基本结束。在哺乳动物和人类基因的功能研究中，Harborth等利用脂质体及质粒分别将编码核纤层蛋白1或2、NUP153、GAS41、ARC21、胞质动力蛋白、蛋白激酶cdk1、或肌动蛋白以及非必须结构基因emerin和zyxin的siRNA转染到Hela、SS6细胞和大鼠F5、FR成纤维细胞内，结果发现上述基因的功能表现与以往使用基因剔除法获得的信息一致。Sui等应用DNA载体体外构建目的基因的siRNA，

14、包括外源绿色荧光蛋白、内源Lamin-A、Lamin-C、cdk-2和dnmt-1基因，转染Hela、H1229、C-33A、U-2OS细胞，结果显示siRNA对目的基因的抑制作用均在86%以上。4.2 研究信号传导通路的新途径联合利用传统的缺失突变技术，RNAi技术可以很容易地确定复杂的信号传导途径中不同基因的上下游关系，Clemens等应用RNAi研究了果蝇细胞系中胰岛素信息传导途径，取得了与已知胰岛素信息传导通路完全一致的结果，在此基础上分析了DSH3PX1（Docksrc homology 3 phox 1）与DACK（Drosophila activated Cdc42 tyrosi

15、ne kinase）之间的关系，证实了DACK是位于DSH3PX1磷酸化的上游激酶。4.3 新药物的研究和开发 RNAi还可以作为寻找新的药物靶标的工具，可以高通量地发现药物靶基因，帮助新药物的研究和开发，了解药物作用的生化模式等。Makimura等利用RNAi技术减少了丘脑下部AGRP（agouti-releted peptide）50%的表达量，AGRP使代谢率提高而不减少摄食量，从而减轻肥胖，为肥胖的治疗提供了一个靶点。美国Genetica公司已将RNAi技术作为高通量药物靶标识别和确认的工具。4.4 基因治疗RNAi只抑制致病基因，而不影响正常等位基因的功能，具有较高的选择性和特异性，

16、能减少非特异作用引起的副作用。4.4.1 治疗病毒感染 可将RNAi视为一种与免疫系统类似的防御机制，利用RNAi技术进行病毒感染的干扰实验已在植物及低等生物中取得满意的结果，但在人体细胞内的实验才刚刚起步。已有研究表明，用siRNA抑制HIV的某些基因，如p24、vif、nef、tat或rev可阻碍HIV在细胞内复制；抑制HIV的受体CD4和CD8a或辅助受体CXCR4或CCR5或病毒结构Gag蛋白的表达可阻碍HIV感染细胞。所以应用siRNA可能成为防止HIV-1感染的一种有效手段。Hamasaki等16构建的siRNA特异性表达载体与HBV病毒DNA共转染人肝癌细胞HuH7和HepG2，

17、降低了RNA及其复制中间体的水平，并引起HBeAg分泌的下降。最近，Song等通过RNAi技术使Fas基因沉默，成功地在自身免疫性肝炎小鼠模型中预防了肝衰竭和肝纤维化。4.4.2 治疗肿瘤 肿瘤发生是多基因相互作用的基因网络调控的结果，传统技术诱发的单一癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长，而RNAi可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性，设计针对这一区段序列的dsRNA分子，只注射一种dsRNA即可以产生多个基因同时沉默的效应，也可以同时注射多种dsRNA而将多个序列不相关的基因同时沉默。Cioca等利用粒细胞白血病细胞系研究了Raf-1 和bcl-2基因在

18、白血病中的作用，表明RNAi能诱导细胞凋亡并能提高肿瘤细胞对化学治疗的敏感性。Zhang等将针对鼠源VEGF（Vascular Endothelial Growth Factor）各亚型基因的siRNA构建成的RNAi表达载体，均特异性抑制了各亚型VEGF的表达，有效的抑制了肿瘤细胞的生长。-连环蛋白和APC基因是Wnt信号通路中的重要组分，突变后引起细胞异常增殖，在肿瘤的发生中起重要作用。Verma等利用RNAi技术使这两个基因表达降低，在细胞和裸鼠中都能抑制肿瘤细胞的增殖。以erbB1、端粒酶为靶点，利用RNAi技术抑制肿瘤的研究也取得了满意结果。4.5 其它应用RNAi还可用于细胞周期调控、代谢、膜转运以及DNA损伤反应、转录或甲基化等多种方面的基因功能研究。最新研究发现，用RNAi技术阻断rdp1(为ErbB3成员)、BRUCE（为一个530kDa的膜