PCR技术的原理、操作及应用.ppt

1、PCR技术的原理、操作和应用、湖南省疾病预防中心微生物检验科黄一伟、PCR是什么、PCR:polymerasechainreaction，即聚合酶链式反应是80年代中期发展的体外核酸扩增技术、PCR技术的发展历史。 关于PCR的文章首次由美国的科学家Kary Mullis等人在Science杂志上发表了在Science杂志上发现耐热性DNA多聚酶Taq酶催化剂(在生活于温泉的水生嗜热杆菌内提取的耐热DNA多聚酶)，预言了分子时代的到来。 12月，Science杂志将PCR及其使用的多聚酶命名为最初的“年度分子”。 1993年kary mull is因PCR的发明获得了诺贝尔化学奖。 PCR技术

2、的原理1、遗传物质：细胞核染色体DNA (由脱氧核糖核酸、磷酸链及盐化学基组成)盐化学基(a、t、c、g )呈双链螺旋排列，由盐化学基序列的长度及序列决定了生物多样性。 例如，人体细胞球有31亿碱基对，以上述的0.1%的差，人和人之间有300万碱基对的差。 PCR的基本工作原理是以扩增的DNA分子为铸造模型，分别以与铸造模型互补的一对寡聚核苷酸片段为引物，在DNA多聚酶的作用下，按照半保留复制的反应历程沿模板链延伸到新的DNA合成完成。 PCR技术原理2、PCR反应的基本成分包括7种基本成分：铸造模型DNA、专一性引物、热稳定DNA多聚酶、脱氧核苷三磷酸(dNTP )、二价阳络离子、缓冲液和一

3、价阳络离子基本反应步骤：改性-退火-拉伸最终通过染料， 例如，重复dNTP 13步骤2535回合，目标DNA片段扩增100万倍以上，DNA双螺旋、DNA单链和引物的复原性、DNA变性形成2条单链，子链将DNA扩增2倍，RT-PCR的原理相对于PCR，在开始阶段为、实时荧光定量PCR的原理1、实时荧光定量PCR技术(Real-Time Quantitative PCR )是在PCR反应体系中放入荧光化学基，利用荧光信号积蓄实时监视整个PCR过程，最后在定标曲线中量化分析未知的数字大板块的方法常用荧光定量PCR试剂： SYBR Green I Taqman水解作用探针，实时荧光定量PCR原理2，基

4、线在PCR扩增反应的前几个循环荧光信号变化不大，接近一直线光阈值threshold的设定一般以PCR反应前的15个周期的荧光信号作为荧光背景信号，荧光域值是PCR3-15个周期的荧光信号标准离差的10倍，荧光域值设定为PCR放大器的指数周期。 CT(Cycle threshold )值表示各PCR反应管内的荧光信号达到设定的结构域值时所经历的循环数。 各数字大板块的CT值与该数字大板块的开始复印数的对数具有线性关系，开始复印数越多，则CT值越小，反之亦然。 可以使用已知的开始拷贝数的标准品来制作定标曲线，横轴表示开始拷贝数的对数，纵轴表示CT值。 因此，如果得到未知样品的CT值，就可以从标准曲

5、线上计算出该样品的初始复制数。 当实时荧光定量PCR的原理3、Ct和初始十位大板块的关系固定为循环数时，荧光信号与十位大板块数成比例，初始DNA量增多，荧光达到阈值所需的循环数(Ct值)越少，则初始十位大板块的对数浓度与Ct具有线性关系，是否是样本的Ct值PCR技术的局限性需要庞大的已知序列的数据库来建构特定的引物并选择性地放大特定的DNA序列，例如优点：特异敏感、快速、简便且易于自动化。 聚合酶链式反应效率差异很大，需要根据因素优化反应条件。 PCR技术的扩增产物长度有限。 建立PCR技术注意事项、污染防治、良好的质量管理。在操作时避免发生气溶胶传播，特别注意阳性样品的取出，使用一次性物品易

6、耗品，戴手套，频繁更换，永远在最后一步加入核酸，液体分注使用。 引物设置修订的合理的Taq酶催化剂扩增错误率高，约1/100盐化学基/20循环的镁络离子浓度对反应效率的影响机器的稳定性、升降温速度、管的紧贴度等RT-PCR应注意防止RNA的分解， 以PCR技术的操作1流感细小病毒的RT-PCR和realtimertPCR检查为例说明PCR技术的操作步骤的主要机器是PCR修正、Real-time PCR修正、微量移液器、高速冷冻离心机、阳离子电泳修正和阳离子电泳槽、凝胶电泳观测器或成像系统， PCR技术的操作2、1 .细小病毒核酸RNA提取2. RT-PCR反应或Real-time RT-PCR

7、反应3. UV紫外线灯检测或在电脑上直接读取结果，流感细小病毒核酸提取1， 试验材料QIAGEN公司的Rneasy Mini Kit (或QIAGEN公司的QIAmp Viral RNA Mini Kit，操作类) -巯基乙醇(-mercaptoethanol) 70%乙醇无菌及DNA、RNA酶催化剂的1.5ml离心管10l、20l、200l， 1000l加样器和枪头可变调制13K微冷冻离心机被检流感病毒200l、流感病毒核酸提取2、1 .将取样液(鼻拭子、咽拭子、胸水等)或细小病毒培养物(鸡胚尿囊液或细胞球培养液) 200ul放入1.5ml的eppendorf管中，制成2，550 ul的rl

8、t 将3.5ul-巯基乙醇和70%的2步混合液600ul吸出到柱中，在12，000r pm下离心15秒钟，将回收管中的离心液4、柱扔掉，返回到回收管中，将2步剩馀的混合液全部吸出到柱中，12， 000rpm，离心15秒，抛弃离心液5，离心15秒6，取出干净的2ml的托说唱乐管，将离心的柱转移到新的托说唱乐管，柱中加入500ul Wash Buffer RPE液，12， 加入000rpm，15秒7离心，丢弃托说唱乐管的离心液，在柱中加入500ulwashbufff，2分钟8离心，将柱转移到干净的1.5ml的eppendrof管中，在柱中加入20-50ul的Rnase-free Water 离心1

9、分钟，收集离心液的即时实验或-20以下的保存试剂盒请注意QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit (catalog #74104 ) :使用试剂盒中的RPE液前加入44ml的无水乙醇，使最终体积为55ml。 RT-PCR反应1、试验材料qiagenonesteprt-PCR kit (cat no 210212 ) RNase inhibitor 40 u/l上游引物200ng/l下游引物200ng/l放大H5亚型禽流感细小病毒的引物序列， h5- 133605-gccattccacataccc-3和h5-:-ctcccctgcttgctatg-3提取的RNA和rt。 在每个管道中添加

10、5英寸一步式PCR缓冲器、51ul 10 mmdntps 1英寸0.13英寸减震器(40 u/ul ) 14.3英寸减震器。 RT-PCR反应3、OneStep RT-PCR反应条件为： 50作用30分钟(逆转录： RNA cDNA) 95作用15分钟(使反转录酶等失活) 94改性30秒55退火30秒72延长30秒第3步，34凝胶电泳缓冲液配方10TBE缓冲液(每升) : tris 107.8 gboricacid 55.0 g EDTA (Na2 ) 8.2g 10 tae缓冲液(每升):Tris48.4g冰冰乙酸11.42g0.5mol/ledtta 100伏特阳离子电泳30分钟，紫外观察

11、和摄影图片拍摄记录。RT-PCR扩增产物检测2、RT-PCR扩增产物检测及结果判定、Real-time RT-PCR的操作1、细小病毒核酸RNA提取：同RT-PCR Real-time RT-PCR :比萨反转录酶n/4根(n为PCR管数)、被检RNA 10l、添加RNA后4 反应条件为42 30min； 92 3min； 9210秒、4530秒721分5周期。 92 10sec、60 30sec 40周期、60点设置荧光收集。 Real-time RT-PCR的操作2、结果分析条件设定读取检查结果。 阈值设定的原则可以根据阈值线正好超过正常阴性对照品的放大曲线的最高点，结果显示阴性的标准或者

12、机器噪声的状况来调整。 CT(Cycle threshold )值表示各PCR反应管内的荧光信号达到设定的结构域值时所经历的循环数。 各数字大板块的CT值与该数字大板块的开始复印数的对数具有线性关系，开始复印数越多，则CT值越小，反之亦然。 可以使用已知的开始拷贝数的标准品来制作定标曲线，横轴表示开始拷贝数的对数，纵轴表示CT值。 因此，如果得到未知样品的CT值，就可以从标准曲线上计算出该样品的初始复制数。 基线是指在PCR放大反应的前几个周期中荧光信号的变化不大、接近一直线的直线，即基线。 光阈值threshold的设定一般以PCR反应前的15个周期的荧光信号作为荧光背景信号，荧光区域值是P

13、CR3-15个周期的荧光信号标准离差的10倍，荧光区域值设定为PCR放大器的指数周期。 Real-time PCR的操作3、结果判定1、质量管理标准1.1阴性对照的检查结果为阴性。 1.2阳性对照的Ct值必须在28.0以下。 否则，这次实验视为无效。 2 .结果判断为2.1 Ct值无数值的样品为阴性样品。 2.2 Ct值为30.0的样本为阳性。 2.3Ct值超过30.0的样品建议重做。 重做结果没有数值的为阴性，没有数值的为阳性。PCR技术的应用、基因克隆、测序和表达等法医学个体识别和亲子鉴定遗传性疾病检查、肿瘤诊断、病原体检查等，基因克隆和表达，DNA指纹技术1，1， 1984年英吉利遗传学

14、家Alec Jeffreys在对肌红蛋白进行DNA序列研究时，意外发现非功能DNA的这15盐化学基左右的DNA片段，在个体间重复的频率和位置显着不同，Jeffreys首先在自各儿的DNA上进行研究，验证这一技术，如果有血缘关系则认为是这些个的Jeffreys命名的技术是DNA指纹技术(DNA指纹印刷)。DNA指纹技术2、采集血样(毛发、精液、口腔黏膜细胞球)，分离DNA，将PCR选定的DNA片段放大比较，统订分析可以判断犯人是否有血缘关系。 分子诊断学、分子诊断学基于分子生物学理论，利用分子生物学技术和方法研究人体内因或外因性生物大分子和大分子体系的存在、结构或表达调控的变化，为疾病的预防、预测、诊断、治疗和转移提供信息和决定依据。 分子诊断学的发展阶段，分子诊断学经历了大体3个阶段： (1)使用DNA分子杂交技术进行遗传病的基因诊断；(2)基于PCR技术的DNA诊断，特别是定量PCR和实时聚合酶链反应的应用，不仅检测宿主中存在的多种DNA和RNA病原体量，而且检测多基因病细胞球中mRNA的表达量分子诊断学的发展方向，分子诊断学的发展方向： (1)分子诊断的内容从传统的DNA诊断发展到核酸及其表达产物(mRNA，蛋白质)的全面诊断。 (2)分子诊断策略从利用分子杂交、P