第三章第四节 发酵培养基灭菌.ppt

1、发酵培养基灭菌,第三章 发酵工业原料及其处理,第一节 培养基的成分及来源 第二节 培养基的类型及选择 第三节 淀粉水解糖的制备 第四节 发酵培养基灭菌,1、培养基如何分类？ 在发酵生产中常用的固体还是液体培养基？ 2、说说培养基的六大营养要素？,复习,根据培养基的用途(特殊用途)不同，可将培养基分成：孢子种子发酵 增殖、选择和鉴别培养基,根据培养基状态不同，可将培养基分成： 固体、液体和半固体培养基,根据营养物质的来源不同，培养基可分为： 天然培养基、合成培养基和半合成培养基,问题1,在发酵生产中，为什么要进行灭菌操作？,1、由于杂菌的污染，使生物反应中的培养物质因杂菌的消 耗而损失，造成生产

2、能力的下降； 2、由于杂菌所产生的一些代谢产物，或在染菌后改变了培养液的某些理化特性，使产物 的提取和分离变得困难，造成收率降低或使产品的质量下降； 3、杂菌会大量繁殖，会改变反应介质的PH值，从而使生物反应发生异常变化； 4、杂菌可能会分解产物，从而使生产过程失败； 5、发生噬菌体污染，微生物细胞被裂解，而使生产失败,问题2,1、为防止杂菌的污染，整个生化生产过程哪些需要注意灭菌？,培养基、发酵设备、空气、菌种制作,发酵培养基灭菌,一、灭菌的原理和方法 二、湿热灭菌原理 三、培养基的湿热灭菌方式 四、灭菌时间计算与影响因素,一、灭菌的原理和方法,消毒与灭菌的区别？,基本概念,消毒 杀死物体表

3、面及内部一部分对人体有害的病原菌的营养体，而对被消毒的物体基本无害的措施，如对皮肤、水果、饮用水的消毒，啤酒、牛奶、果汁等消毒。 灭菌 杀死任何物体内外的一切微生物的方法，灭菌后的物体不再有可存活的微生物。,1、化学试剂灭菌法,化学试剂：甲醛、乙醇或新洁尔灭、高锰酸钾等 适用范围：环境空气、皮肤及器械的表面消毒,2、射线灭菌法,电磁波、紫外线或放射性物质 适用范围：无菌室、接种箱,3、干热灭菌法,常用烘箱，灭菌条件为在160下保温1h 适用范围：金属或玻璃器皿,4、湿热灭菌法,利用饱和蒸汽进行灭菌、条件为：121，30 适用范围：广泛应用于生产设备及培养基的灭菌 例：高压灭菌锅,5、过滤除菌法

4、,利用过滤方法阻留微生物 适用范围：制备无菌空气,6、火焰灭菌法,酒精灯火焰 适用范围：接种针、玻璃棒、三角瓶口,灭菌方法 连线题,接种针、试管口 环境空气、皮肤表面 无菌室、接种箱 培养基的灭菌 空气,过滤除菌法 火焰灭菌法 湿热灭菌法 射线灭菌法 化学试剂灭菌法,二、湿热灭菌原理,湿热灭菌原理,灭菌条件,灭菌不利方面,由于蒸汽具有很强的穿透能力，而且在冷凝时会放出大量的冷凝热(潜热)，很容易使蛋白质凝固而杀死各种微生物。,121，30min。,同时也会破坏培养基中的营养成分，甚至会产生不利于菌体生长的物质。因此，在工业培养过程中，除了尽可能杀死培养基中的杂菌外，还要尽可能减少培养基中营养成

5、分的损失,1、衡量热灭菌指标,致死温度：杀死微生物的极限温度。 致死时间：在此温度下，杀死全部微生物所需要的时间。 热 阻：对热的抵抗力，指微生物在某一特定条件 （主要是温度和加热方式）下的致死时间。,相对热阻：几种微生物对热的相对抵抗能力。 指微生物在某一特定条件下的致死时间与 另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。,相对热阻,从表中可看出,芽孢或孢子的热阻要比生长期营养细胞的热阻大得多，这是由于芽孢或孢子内吡啶二羧酸含量对热阻的增加有关。另外，芽孢子中蛋白质含水量较营养细胞低（特别是游离水分少），也是芽孢耐热强的一个原因。,对培养基和发酵设备的灭菌，广泛使用湿热灭菌法。 工厂蒸汽比较容易

6、获得，控制操作条件方便，简单而又价廉、有效 处理培养基加热受热时间与灭菌程度和营养成分的破坏都有关系。 营养成分的减少将影响菌种的培养和产物的生成 所以灭菌程度和营养成分的破坏成为灭菌工作中的主要矛盾，恰当掌握加热受热时间是灭菌工作的关键。,受热时间如何确定？,2、 微生物的死亡速率：对数残留定律,微生物受热死亡的原因，主要是因高温使微生物体内的一些重要蛋白质，如酶等，发生凝固、变性，从而导致微生物无法生存而死亡。微生物受热而丧失活力，但其物理性质不变。,在一定温度下，微生物的受热死亡遵照分子反应速度理论。在灭菌过程中，活菌数逐渐减少，其减少量随残留活菌数的减少而递减，即微生物的死亡速率与任一

7、瞬时残存的活菌数成正比，,式中，N残存的活菌数；t灭菌时间（s）；K灭菌速度常数（s-1），也称反 应速度常数或比死亡速度常数，此常数的大小与微生物的种类与加热温度有关； dN/dt活菌数瞬时变化速率，即死亡速率。 积分得：,式中：N0开始灭菌（t=0）时原有活菌数； Nt-经时间t后残存活菌数。,微生物的死亡速率与任一瞬时残存的活菌数成正比，,灭菌速度常数K是判断微生物受热死亡难易程度 的基本依据。 各种微生物在同样的温度下K值是不同的 K值愈小，则此微生物愈耐热。,问题,在121度，枯草杆菌FS5230的K为0.047s-1，梭状芽孢杆菌PA3679的K值为0.03 s-1 ，请问哪一种微

8、生物更耐热？,1）如微生物存在芽孢，其死亡速率呈现非对数死亡定律 ; 2）同一种微生物在不同的灭菌温度下，k值不同，灭菌温度愈低，k值愈小；温度愈高，k值愈大。 3）如果要达到彻底灭菌，Nt等于0，则灭菌所需的 时间应为无限长，这在实际中是不可能的。 工程上，Nt=0.001，即在1000次灭菌中， 允许有一次失败;,注：,3、灭菌温度和时间的选择,当培养基被加热灭菌时，常会出现这样的矛盾，这就是，加热时，微生物固然会被杀死，但培养基中的有用成分也会随之遭到破坏，那么有何良策可以既达到灭菌要求，同时又不破坏或尽可能少破坏培养基中的有用成分呢？ 实践证明，在高压加热的情况下，培养基中的氨基酸和维

9、生素极易被破坏，如在121，仅20min，就有59%的赖氨酸和精氨酸及其他碱性氨基酸被破坏，蛋氨酸和色氨酸也有相当数量被破坏。因此，必须选择一个既能满足灭菌需要，又可使培养基的破坏尽可能小的灭菌工艺条件。,微生物的受热死亡属于单分子反应，其灭菌速率常数K与温度之间的关系可用 阿累尼乌斯公式表示：,A-频率常数，也称阿累尼乌斯常数，s-1； R-气体常数，8.314J/molK； T-绝对温度，K； E-微生物死亡活化能，J/mol。,K灭菌速度常数（s-1），也称反应速度常数或比死亡速度常数.,从上式可知，K值的大小与微生物的种类与加热温度有关,灭菌时，培养基成分分解速率常数K与温度之间的关系

10、也可用 阿累尼乌斯公式表示：,K-培养基内易被破坏成分的分解速率常数； A-频率常数，也称阿累尼乌斯常数，s-1； R-气体常数，8.314J/molK；T-绝对温度，K； E-培养基成分分解所需活化能，J/mol。,当培养基成分从T1上升到T2时，微生物的死亡速率与培养基的分解有如下 关系：,通过实验测定可知： 灭菌时杀死微生物的活化能大于培养基成分的破坏活化能值， 因此：,即随着温度的上升，微生物的死亡速率常数增加倍数要大于培养基成分的破坏速率的增加倍数。 也就是说， 结论1：当灭菌温度上升时，微生物死亡速率的提高要超过培养基成分的破坏速率的增加。,分析:在热灭菌过程中，同时会发生微生物死

11、亡和培养基破坏这两种过程，且这两种过程的进行速度都随温度的升高而加速，但微生物的死亡速率随温度的升高更为显著。 据测定：每升高10时一般化学反应的反应速率的增加倍数是1.5-2.0，而杀死芽孢为5-10，杀死微生物细胞为35左右。,同样的灭菌效果,由此可见，若要减少营养成分的破坏，可升高温度灭菌。 结论2：在灭菌时选择较高的温度、较短的时间，这样便既可达到需要的灭菌程度， 同时又可减少营养物质的损失。,问题,灭菌要达到杀死99.99%的细菌芽孢，有两种方法可以采用，一种是118灭菌15min，另一种是128灭菌5min。哪一种方法好，为什么？,答：从理论研究和生产实践都可证明，在灭菌过程中，同

12、时会发生微生物死亡和培养基破坏这两种过程，且这两种过程的进行速度都随温度的升高而加速，但微生物的死亡速率随温度的升高更为显著。 因此，对于同一灭菌效果，选择较高的温度、较短的时间，这样便既可达到需要的灭菌程度，同时又可减少营养物质的损失。,三、培养基的湿热灭菌方式,1、间歇灭菌（分批灭菌、实消） 2、连续灭菌（连消）,1、间歇灭菌（分批灭菌、实消）,定义：将配制好的培养基同时放在发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起进行加热灭菌的过程，通常也称为实罐灭菌。（常用）,发酵罐,1）基本概念,240,160,120,80,时间（min),0,50,100,150,温度,升温,冷却,保温,

13、过程包括：升温、保温和冷却等三个阶段。 各阶段对灭菌的贡献：20%、75%、5%,从以上分析可知，灭菌过程中加热和保温阶段的灭菌作用是主要的，而冷却阶段的灭菌作用是次要的，一般很小，可以忽略不计。 此外，还应指出的是，应当避免长时间的加热阶段，因为加热时间过长，不仅破坏营养物质，而且也有可能引起培养液中某些有害物质的生成，从而影响培养过程的顺利进行。,各阶段对灭菌的贡献：20%、75%、5%,在实际生产中，也可能遇到所供蒸汽不足、温度不够高的情况，这时可以适当延长灭菌时间。 生产上甚至有用100蒸煮而达到彻底灭菌的实例。 如要做固体曲而没有高温蒸汽时，可将原料用100蒸汽蒸30min， 杀死其

14、中的营养细胞， 但孢子与细菌的芽孢没有被杀死。 将蒸过的原料置于室温下过夜， 未被杀死的孢子便发芽生长，芽孢发育成营养细胞，再30min便可杀死。如此连续反复进行2-3次，亦可达到彻底灭菌的目的。,3）间歇灭菌的操作,间歇灭歇是在所用的发酵罐或其他培养装置中进行的，它是在配制罐中配好培养基后，通过专用管道输入发酵罐等培养设备中，然后开始灭菌。在进行培养基的间歇灭菌之前，通常先将发酵罐等培养装置的分空气过滤器进行灭菌，并且用空气将分过滤器吹干。开始灭菌时，应先放去夹套或蛇管中的冷水，开启排气管阀，通过空气管向发酵罐内的培养基通入蒸汽进行加热，同时，也可在夹套内通蒸汽进行间接加热。当培养基温度升到

15、70左右时，从取样管和放料管向罐内通入蒸汽进一步加热，当温度升至120，罐压为1*105Pa（表压）时，打开接种、补料、消泡剂、酸、碱等管道阀门进行排汽，当然在保温过程中，应注意凡在培养基液面下的各种进口管道都应通入蒸汽，而在液面以上的其余各管道则应排放蒸汽，这样才能不留死角，从而保证灭菌彻底。保温结束后，依次关闭各排汽、进汽阀门，待罐内压力低于空气压力后，向罐内通入无菌空气，在夹套或蛇管中通冷水降温，使培养基的温度降到所需的温度，进行下一步的发酵和培养。 由于培养基的间歇灭菌不需要专门的灭菌设备，投资少，对设备要求简单，对蒸汽的要求也比较低，且灭菌效果可靠，因此，间歇灭菌是中小型生产工厂经常

16、采用的一种培养基灭菌方法。,2、连续灭菌（连消）,1）定义：,将配制好的培养基在向发酵罐等培养 装置输送的同时进行加热、 保温和冷却 而进行灭菌。,连续灭菌时，培养基可在短时间内加热到保温温度，并且能很快地被冷却 因此可在比间歇灭菌更高的温度下进行灭菌 而由于灭菌温度很高，保温时间就相应地可以很短 极有利于减少培养基中的营养物质的破坏。,连续灭菌的基本设备有哪些 ？,问题,发酵罐,蒸汽,蒸汽,冷却水,无菌培养基,配料罐,泵,加热塔,维持罐,冷却管,连续灭菌的基本设备一般包括（1）配料预热罐，将配制好的料液预热到60-70，以避免连续灭菌时由于料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声；（2）连消塔

17、，连消塔的作用主要是使高温蒸汽与料液迅速接触混和，并使料液的温度很快升高到灭菌温度（126-132）；（3）维持罐，连消塔加热的时间很短，光靠这段时间的灭菌是不够的，维持罐的作用是使料液在灭菌温度下保持5-7min，以达到灭菌的目的；（4）冷却管，从维持罐出来的料液要经过冷却排管进行冷却，生产上一般采用冷水喷淋冷却，冷却到40-50后，输送到预先已经灭菌过的罐内。,喷射加热连续灭菌流程,灭菌介质,原料介质,蒸汽,T=140度,保温段,真空,流程中采用了蒸汽喷射器，它使培养液与高温蒸汽直接接触，从而在短时间内可将培养液急速升温至预定的灭菌温度然后在该温度下维持一段时间灭菌，灭菌后的培养基通过一膨

18、胀阀进入真空冷却器急速冷却，从图中可以看出，由于该流程中培养基受热时间短，营养物质的损失也就不很严重，同时该流程保证了培养基物料先进先出，避免了过热或灭菌不彻底等现象。,薄板换热器连续灭菌流程,进料 35,100 ,120 ,维持罐120 ,蒸汽147 ,120 ,55 ,出料35 ,水20 ,31 ,流程中采用了薄板换热器作为培养液的加热和冷却器，蒸汽在薄板换热器的加热段使培养液的温度升高，经维持段保温一定时间后，培养基在薄板换热器的冷却段进行冷却，从而使培养基的预热、加热灭菌及冷却过程可在同一设备内完成。该流程的加热和冷却时间比喷射加热连续灭菌流程要长些，但由于在培养基的预热过程同时也起到

19、了灭菌后培养基的冷却，因而节约了蒸汽和冷却水的用量。,分别说出优点,3）间歇灭菌与连续灭菌的比较,加热器、维持罐（管）和冷却器以及发酵罐等都应先进灭菌,由表可见，无论在理论上或者在实践上，与间歇灭菌过程相比，连续灭菌的优点十分明显。因此，连续灭菌越来越多地被用培养基的灭菌。,四、灭菌时间计算与影响因素,A、分批灭菌（实罐灭菌） 一般可以不计升温阶段所杀灭的菌数，把培养基中所有的菌均看作是在保温阶段（灭菌温度）被杀灭，这样可以简单地利用式，粗略地求得灭菌所需的时间,1）培养基灭菌时间的计算,解： N0=40 106 2 105=8 1012（个） Nt=0.001（个） K= 1.8min-1,

20、例：有一发酵罐内装40m3培养基，在121温度下进行实罐灭菌。原污染程度为每1mL有2*105个耐热细菌芽孢，121度时灭菌速度常数为1.8min-1。求灭菌失败机率为0.001时所需要的灭菌时间。,但是实际上，培养基在加热升温时（即在升温阶段）就会有部分菌被杀灭，特别是当培养基加热到100度以上，这个作用较为显著。因此，保温灭菌时间实际上比上述计算的要短。 严格地讲，在降温阶段也有杀菌作用，但降温时间短，在计算时一般不考虑。,【例2】上例中，灭菌过程的升温阶段，培养基从100上升至121，共需15min。求升温阶段结束时，培养基中芽孢数和保温所需时间。 解 T1373K T2394K 根据公式求得373K至394K之间若干k值，k-T关系如下表 表 k-T关系,由此可得,图解积分法,根据公式，求升温阶段结束时培养基中残留的芽孢数为,根据灭菌公式，求得保温所需的时间,B、连续灭菌（连消）,连续灭菌的灭菌时间，仍可用灭菌公式计算，但培养基中的含菌数，应改为每单位体积(1mL)培养基的含菌数，则灭菌公式变换为下式,式中 c0单位体积培养基灭菌前的含菌数，个mL ; cs单位体积培养基灭菌后的含菌数，个