第3章高效液相色谱.ppt

1、High Performance Liquid Chromatography, HPLC,第3章高效液相色谱法,高效液相色谱与其他仪器相比特点： （1）高压 （2）高速 （3）高效 （4）高灵敏度,3-1 高效液相色谱法概述,高效液相色谱法概述,经典的液相色谱法与现代液相色谱法的比较 1.流动相的输送形式不同。 2.分析周期不同。 3.柱效不同。 液相色谱与气相色谱的比较 相同点：液相色谱所用基本概念：保留值、塔板数、塔板高度、分离度、选择性等与气相色谱一致。液相色谱所用基本理论：塔板理论与速率方程也与气相色谱基本一致。 根据保留值定性、根据峰高或峰面积定量。,不同点： （1）应用范围不同 气

2、相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物质。对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物的分离、分析较为困难。 液相色谱则不受样品挥发度和热稳定性的限制，它非常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物及高聚物的分离分析。,（2）液相色谱能完成难度较高的分离工作 气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与分配平衡过程。 液相色谱中流动相液体也与固定相争夺样品分子，为提高选择性增加了一个因素。 液相色谱固定相类型多，作为分析时选择余地大； 液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般有利于色谱分离条件的选择。 （3）液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较

3、容易，而且回收是定量的，适合于大量制备。但液相色谱尚缺乏通用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。在实际应用中，这两种色谱技术是互相补充的。,3-2 影响液相色谱柱的因素,1. 涡流扩散项He He=2dp dp:固定相平均颗粒直径，为固定相的填充不均匀因子。 使用细小的颗粒，填充均匀，可减小涡流扩散项。,纵向扩散项Hd Hd=CdDm/u 分子在液体中的扩散系数比在气体中小45 个数量级，对色谱峰扩散的影响可忽略。 传质阻力项 固定相传质阻力项和流动相传质阻力项 H(Csdf2/Ds+Cmdp2/Dm+Csmdp2/Dm)u 是影响柱效能的主要因素，固定相颗粒越 小，H越小,提高液相色谱的分离效

4、率，必须提高柱内填料装填的均匀性、减小粒度、使用低黏度的流动相或适当提高柱温以降低流动相黏度，从而加快传质速率，其中减小粒度是提高柱效的最有效途径,区别：气相色谱的曲线有一个最低点（最佳流速），液相色谱中，分子扩散项影响较小，流动相的流速于板高成直线关系，流速增大，板高增加，柱效降低，为了兼顾柱效与分析速度，一般都尽可能地采用较低流速。,3-3 高效液相色谱法的主要类型 及其分离原理 按分离机理不同分为：液液分配色谱、液固色谱、离子交换色谱、离子对色谱、离子对色谱、离子色谱法和空间排阻色谱,分离系统由两相固定相和流动相组成 液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键合固定相（或在惰性载体表面涂上一层

5、液膜）、离子交换树脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂。 根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异进行分离。,液液分配色谱法,在液液色谱中，一个液相作为流动相，而另一个液相则涂渍在很细惰性载体或硅胶上作为固定相。流动相与固定相应互不相溶，两者之间应有一明显的分界面。分配系数（K）或分配比（k）小的组分，保留值小，先流出柱。,正相液液色谱法(Normal phase Chromatography)：流动相极性小于固定相极性，又称为正相洗脱或正相冲洗。 极性小的先流出色谱柱，极性大的后流出色谱柱，适合于分离极性化合物。 反相液液色谱法(Reversed pha

6、se Chromatography)：流动相极性大于固定相极性，又称为反相洗脱或反相冲洗。 极性小的后流出色谱柱，极性大的先流出色谱柱，适合于分离芳烃、稠环芳烃及烷烃等化合物。,正相色谱固定相：硅胶、三氧化铝以及载有醇基、氨基和氰基的固定相。流动相选用非极性流动相，如：正已烷或环已烷 正相色谱依据溶剂极性差别达到分离目的。 反相色谱固定相：非极性载体。固定相以硅胶为基质，将不同疏水基团通过化学键合到硅胶表面的游离羟基上（如键合C18烷基的非极性固定相，为C18柱） 大多数有机化合物都存在疏水基团，因此，反相色谱较为普遍。,在液液色谱中，除一般要求外，还要求流动相对固定相的溶解度尽可能小，因此固

7、定液和流动相的性质往往处于两个极端，例如当选择固定液是极性物质时，所选用的流动相通常是极性很小的溶剂或非极性溶剂。,液固吸附色谱法,液固色谱法是根据各组分在固定相上的吸附能力的差异进行分离。 吸附剂是一些多孔的固体颗粒物质，吸附试样的能力，主要取决于吸附剂的比表面积和理化性质，试样的组成和结构以及洗脱液的性质等。 一、液固色谱法固定相 酸性吸附剂：硅胶、硅酸镁 碱性吸附剂：氧化铝 氧化镁,流动相：液体 固定相：吸附剂（主要是多孔物质，如硅胶、氧化铝、硅藻土等） 适合分离中等相对分子质量（200M2000），能溶于非极性或中等极性溶剂的脂溶性样品的分离。凡能在薄层上成功分离的化合物，也可用液固色

8、谱分离。,固体吸附剂按其性质可分为极性和非极性两种 极性吸附剂包括硅胶、氧化铝、氧化镁、 硅酸镁、分子筛及聚酰胺等。 非极性吸附剂最常见的是活性炭。 各种吸附剂中，最常用的吸附剂是硅胶，其次是氧化铝,液固色谱法流动相必须符合下列要求： （1）能溶解样品，但不能与样品发生反应。 （2）与固定相不互溶，也不发生不可逆反应。 （3）粘度要尽可能小，这样才能有较高的渗透性和柱效。 （4）应与所用检测器相匹配。例如利用紫外检测器时，溶剂要不吸收紫外光。 （5）容易精制、纯化、毒性小，不易着火、价格尽量便宜等。,在液-固色谱中，选择流动相的基本原则是 极性大的试样用极性较强的流动相，极性小的则用低极性流动

9、相。,(1) 分离机理 试样中的离子与离子交换树脂上的离子发生反应： 阳离子交换：树脂SO3-H+M+=树脂SO3-M +H + 阴离子交换：树脂NR4Cl-+X-=树脂NR4X -+Cl - 不同的离子与树脂离子的交换能力（亲和能力）不同，亲和力越大，离子越难洗脱，从而得以分离。,离子交换色谱法（ion exchangechromatogrephy,IEC）,离子交换色谱法（ion exchangechromatogrephy,IEC）,固定相：带有离子交换功能的基团，是在交联的高分子骨架上结合可解离的无机基团。 离子交换剂的本体结构不发生明显变化，而是其上带有的离子与外界同电性的离子发生等

10、量离子交换。,由薄壳型或全多孔球型微粒硅胶表面键合上各种离子交换基团制成，如在树脂上键合SO3H基团（树脂SO3H），可交换基团H 不同样品离子对离子交换树脂所带电荷的结合力不同，使洗脱剂可以借助逐渐升高离子浓度（即离子梯度）的方式，使结合力弱的离子先流出，结合力强的后洗脱。,离子交换色谱法（ion exchangechromatogrephy,IEC）,SO3H + M+,SO3M + H+,离子对色谱（ion pair chromatography）,离子对色谱：将一种（或多种）与溶质分子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成离子对化合物，从而控制溶质

11、离子的保留行为。 分为正相离子对色谱、反相离子对色谱,固定相、流动相和离子对试剂,固定相：多为C18,C8反相键合相 流动相：以水为主的缓冲液，或水-甲醇、水-乙腈等混合溶剂 离子对试剂：四丁基铵正离子、十六烷基三甲基铵正离子，ClO4-，十二烷基磺酸根等,应 用,有机酸、有机碱特别是强酸 强碱的分析，如羧酸、磺酸、 胺类、酚类、药物、染料等,空间排阻色谱法（size exclusion chromatography,SEC）,空间排阻色谱法是一种按溶质分子在流动相溶液中的体积大小分离的色谱法，以凝胶为固定相，其分离机理与其他色谱完全不同。 适合于分离分子质量大（M2000）的化合物，只能分离

12、相对分子质量差别在10%以上的分子，不能分离大小相似，相对分子质量接近的分子。,分离原理示意图,3-4 液相色谱固定相,1.液相色谱固定相 固定相又称为柱填料，采用310m 的微粒固定相。 分类：按化学组成 微粒硅胶、高分子微球、微粒多孔碳 310m 的微粒硅胶是主要的填料，机械强度好，容易控制的孔结构和表面积，较好的化学稳定性和化学反应专一性。,化学键合相,固定相是通过化学反应把各种不同的有机基团键合到硅胶（载体）表面的游离羟基上，代替机械涂渍的液体固定相。 化学键合色谱适用于分离几乎所有类型的化合物。 根据键合相与流动相之间相对极性的强弱，可将键合相色谱分为极性键合相色谱和非极性键合相色谱

13、。,化学键合相,1.非极性键合相：表面基团为非极性烃基，如十八烷基、辛烷基等。 C18最常见的非极性键合相,R=-CH3 -C4Hg -C8H17 octyl -C18H37 n-octyldecyl-ODS,液相色谱流动相 既可携带样品，也进行分配 要求如下： （1）黏度小。（2）沸点低、固体残留物少（3）与检测器相适应 （4）与色谱系统相适应 （5）溶剂纯度,固定相和流动相的选择,根据样品的极性，对选择十分关键，一般官能团相对极性大致顺序为： CxHy 醚 酯 酮 醛 亚胺 氨 醇水 要获得较好的分离度，则要求仔细考察样品，流动相固定相的极性配合与平衡。但有关理论并不完善，大多数还是用实验

14、方法获得。先选一种柱子试，反复之后，不行再换。,3-6 高效液相色谱仪,液体输送系统、进样系统、分离系统、检测系统,溶剂在放入贮液罐前必须经过0.45m滤膜过滤，除去溶剂中的杂质。 流动相在使用前必须脱气处理，除去其中溶解的气体。 常用的脱气方法：吹氦脱气法、加热回流法、抽真空脱气法、超声脱气法,液体输送系统,储液瓶、高压泵、梯度洗脱装置,梯度洗脱装置 通过两个输液泵流速的变化，改变流动相的洗脱能力，其作用与气相色谱的程序升温类似。,C,低压溶剂梯度方框图,高压溶剂梯度方框图,梯度洗脱流程,进 样 系 统,六通进样阀结构示意图,分离系统色谱柱,包括柱管与固定相两部分 一般色谱柱长530cm，内

15、径为45mm 凝胶色谱柱内径312mm 微柱内径1-2mm，长1-5cm 制备往内径较大，可达25mm 以上,检测系统,通用型检测器：示差折光检测器、电导检测器、蒸发光散射检测器 选择性检测器：紫外检测器、荧光检测器,检测系统,紫外检测器 示差折光检测器 荧光检测器 电导检测器,紫外检测器,固定波长的紫外检测器 可变波长的紫外检测器 二极管阵列检测器,被分析试样组分对特定波长紫外光的选择性吸收，符合朗伯比耳定律,固定波长的紫外检测器,可变波长的紫外检测器,二极管阵列检测器,二极管阵列检测器之三维图,响应特性,选择性检测器，如芳烃类化合物的检测 灵敏度高，可检测10-9g/mL的物质 线性范围宽，104-105 对温度及流动相的改变不敏感 适合梯度洗提 HPLC常规检测器,（2）示差折光检测器,结构,基于连续测定色谱柱流出物光折射率的变化而测定样品浓度。,响应特性,通用性检测器 低灵敏度 基线易受温度的影响 不适合梯度洗脱,荧光检测器,结构,响应特性,选择性检测器。如PAH，蛋白质 高灵敏度，比紫外高约1000倍 适合梯度洗提,电导检测器,根据物质在某些介质中电离后所