第二章 生物大分子（2 RNA）

1、二、RNA,1. RNA 的种类 2. RNA的结构 3 RNA的进化 4.RNA的功能 5. RNA的提取,1.RNA的种类,rRNA: 占80-85% tRNA 非编码RNA（ncRNA） mRNA: 占1-5%,占15-20%,rRNA: 34种 tRNA：约50种 mRNA：在1000种以上.,原核生物与真核生物核糖体成分的比较,1. RNA的结构,含有尿嘧啶、核糖的单链,RNA的一级结构：核苷酸的排列顺序,hairpin,bulge,loop,Pseudoknots （假结）,RNA分子的二级结构 碱基配对,RNA内部的非Watson-Crick碱基对 G:U 是另外的常见配对，增强

2、了RNA自我互补配对的能力。 RNA链自身折叠形成的局部双螺旋类似A型DNA。,Figure 6-33 G:U base pair,RNA的二级结构,非典型的碱基配对,RNA的三级结构：空间构象 由于RNA没有形成长的规则螺旋的限制，因此可以形成大量的三级结构。 对RNA三维结构的认识主要来自于对tRNA的研究，因为获得分子量较大的RNA的结晶较为困难。,X-射线晶体学研究显示，细胞中的tRNA是以L-形的三维结构存在的（酵母的丙氨酰tRNA 76nt）， tRNA在溶液中的构型与其晶体结构一致 。,1965年完成测序 1968年诺贝尔奖,1974年,大肠杆菌核糖体的典型三维结构，电镜、X射线

3、晶体学、生化方法的结合,大肠杆菌70S核糖体的 三维结构,莱马克里斯南,施泰茨,尤纳斯,2009年诺贝尔化学奖得主,3. 关于RNA的进化,RNA作为原始分子的概念则是1968年Crick和Orgel，1967年Woese分别提出的。 1972年和1993年，Noller等提供了一系列的证据说明核糖体RNA比核糖体蛋白在核糖体的功能中更加重要，为早期的推测提供了实验证据。 1982年和1983年， RNA催化功能的发现为RNA世界合理性的构筑提供了更加坚实的基础。 RNA世界(RNA world)是Gilbert在1986年提出的，其主要兴趣在于催化性的RNA是怎么产生了基因的外显子-内含子结

4、构的。,RNA functioned as both a carrier of information and an enzyme. RNA catalyzed the synthesis of proteins, and these proteins catalyzed the transition from RNA to DNA. Proteins and RNPs catalyze the replication of DNA.,生物大分子进化中的地位,RNA世界经历了三个阶段： （1）原始的RNA世界 40亿年前，RNA分子具有双重作用，既是信息分子也是生物催化剂，构成了一个自我复制的

5、系统，与其他的核酶一起催化复杂的代谢，并构成了独立的早期生命形式。,（2）当今的RNA： 偶尔独自发挥作用，例如：核酶、核糖开关； 多数情况下，与蛋白质协同起作用，例如：核糖体和剪接体中的RNA组分保留了催化活性，在端粒酶和信号识别颗粒中，起催化作用的则是蛋白质； RNAi机制中，RNA的作用则减少到一个简单的引导序列这一功能。,（3）RNA技术的应用 虽诞生仅半个世纪，但是一个充满活力的领域。 例如：利用适配体（aptamers）检测人体血清中多种蛋白的浓度在临床上有应用价值；miRNA和反义核酸（抑制miRNA）具有制药潜力，成为众多制药公司研发的内容之一。,4 RNA的功能,信使功能：

6、催化功能： 调控功能：,mRNA是遗传信息传递的中介分子。 RNA也可以作为一些病毒的遗传物质，这些病毒的基因组可以自我复制或者通过DNA中介进行复制。,（1）信使功能,RNA涉及多种生物学过程,（2）催化功能,1982, Thomas Cech发现Tetrahymena thermophila的26S rRNA的单个内含子在体外具有自我剪接的能力。 1983, Sidney Altman发现Escherichia coli的RNase P 中的RNA组分在体外，能够在没有其蛋白质亚基的条件下进行tRNA前体的加工 。 1989,Cech 和Altman因此获得诺贝尔化学奖。,切赫(Thoma

7、s Robert Cech) 美国斯坦福大学医学院 资源网址: /,1989年诺贝尔化学奖,奥尔特曼(Sidney Altman) 美国耶鲁大学 资源网址:/facultystaff/altman.html facultystaff/altman.html,Self-splicing of Tetrahymena thermophila preribosomal RNA(pre-rRNA),电镜观察17S和26S rRNA 与rDNA的杂交结果 同位素标记26S 前体RNA在体外以SP6 R

8、NA聚合酶进行转录。 0：未进一步孵育 -：在30孵育75min，不加GTP +：在30孵育75min，加GTP P为前体RNA,E为连接起来的外显子， C、 L和N为剪接下来的不同形式的内含子,RNase P可以催化tRNA的成熟,(A) tRNA分子的5前导序列的剪接由RNase P 催化 （B)人类RNase P的重组内切活性的检测，说明RNase P的蛋白亚基对其催化 活性是必须的，单独的H1 RNA无法将前导序列从tRNA上移去。 S为未切割底物tRNATyr，Ctrl为纯化的人类RNase P的对照，Rpp是蛋白亚基,RNP参与多种生物学过程,一些RNA可以直接控制基因表达，调控途

9、径多样，包括不同的RNA折叠，核糖开关，与非编码RNA有关的RNA干扰现象、X染色体随机失活现象等。,(3)调控功能, RNA的不同折叠: 细菌中的色氨酸操纵子是典型例子。,大肠杆菌中色氨酸操纵子的转录衰减,由RNA折叠的变化介导的抑制，转录衰减效应可以达到10倍。,抗终止,终止,终止子发夹形成,抗终止子发夹形成,细胞内色氨酸充足时，核糖体不会在 TrpL上串联的Trp密码子处停留，迅速到达TrpL的终止密码。,衰减：细胞内的色氨酸不足时，核糖体停滞 在TrpL上串联的Trp密码子处停留，形成 抗终止发夹，结构基因trpEDCBA的转录 发生。,由蛋白质介导的抑制与 RNA折叠的变化介导的抑制

10、方式并存时，色氨酸操纵子结构基因的转录水平可以改变600倍。,在缺乏色氨酸时，编码色氨酸生物 合成的酶正常转录翻译。,细胞内色氨酸充足的时候，与二聚体化的色氨酸 抑制蛋白结合，诱导其构象的变化，使抑制蛋白 和操纵子结合，阻碍了RNA聚合酶靠近启动子。,核糖开关 （Riboswitches）,RNA可以与小分子结合，例如:鸟嘌呤、赖氨酸等，从而改变RNA的结构，是细菌中普遍存在的基因表达的调控方式，该现象在植物中也有发现。,一些mRNAs分子中的特定结构域选择性的结合一些代谢物，作为可以调节的“开-关”元件，在不需要蛋白转录因子的条件下就能够控制基因的表达，称为核糖开关。,因此，RNA在功能上就

11、可以作为不同信号的感受器，感受温度、盐浓度、离子、氨基酸和其他小分子有机代谢物的变化。 核糖开关的典型位置是在mRNAs分子的5非翻译区（5-untranslated regions，5-UTR）。,在结构上，绝大部分的核糖开关可以粗略分成两个结构域： 适配体（aptamer）: 与靶代谢物选择性结合的RNA序列，长度在100nt以内。 表达平台（“expression platform”）: 在代谢物结合时，通过改变RNA的折叠形式，影响基因表达。,核糖开关的作用机制,左侧：转录水平的调控涉及到代谢物的结合，特定构象适配体的稳定，进一步形成终止子发夹，阻止全长mRNA的转录。 右侧：翻译水平

12、的调控则是通过代谢物或温度诱导的结构变化，阻止核糖体和mRNA的结合。,核糖开关的作用机制： 通过对小分子的浓度改变进行应答，来调控基因的表达，这一调控是通过改变RNA的二级结构来完成的。,2004年发现具有催化活性的RNA参与了遗传调控。 例如：glmS对添加的GlcN6P 应答，进而切割自身mRNA。,GlmS是6-磷酸葡糖胺（GlcN6P）合成相关的酶，由glmS mRNA编码， 其中含有核酶序列。 在有GlcN6P时，核酶切割自身的mRNA，阻止进一步的生成GlcN6P。,RNA干扰： 不仅涉及mRNA水平的事件，也调节染色质的结构。实际上，在染色体着丝粒区高度异染色质化的维持依赖RN

13、Ai的活性。, X染色体随机失活 大分子量的ncRNA常常在合成它们的染色体位点上起作用，通过吸引蛋白对染色质进行修饰，关闭基因表达，这种效应可以扩展到整条染色体，例如：Xist RNA将整条X染色体凝集，产生基因剂量补偿（gene dosage compensation）。,RNA的生物学功能,RNA 是一些病毒的遗传物质。 与蛋白质合成有关，mRNA 在功能上是基因和蛋白合成机器之间的中介；tRNA在功能上是mRNA上密码子和氨基酸之间的衔接分子。 有些RNA具有催化活性（核酶） 。 RNA可以通过多种途径调节基因表达。,5. RNA的提取,提取原则：一般分子量较小，不易被机械拉力打断；最

14、重要的是抑制RNA酶（RNase）的活性，防止RNA被降解。 RNase的特点： 该酶的稳定性极高，活性也不依赖二价阳离子，可以耐受多种处理（煮沸、酸、碱等）而不失活。 存在广泛，环境中的灰尘、实验器皿、试剂以及人的汗液、唾液中均存在。,RNA操作的要点创造一个无RNA酶的环境！,（1） 防止外源RNase污染: 洁净实验室环境 一次性手套，勤换；操作时可以带口罩。 环境洁净（避免飞尘中细菌、真菌产生外源性RNA酶污染，无空气对流） 玻璃和塑料器皿处理 玻璃：常规洗净后，200干烤4小时 塑料器皿（离心管、枪头等）：用0.1%的DEPC水常温浸泡过夜，灭菌干燥后使用。 溶液配制：加0.1%DE

15、PC处理的双蒸水配制，高压除去残留的DEPC。,DEPC的特点和使用,DEPC （焦碳酸二乙酯）是一种强烈但并不彻底的RNA酶抑制剂，通过和RNA酶中His结合使蛋白质变性，抑制RNA酶活性。 DEPC是一种潜在的致癌物质，在操作中应尽量在通风的条件下进行，并避免接触皮肤，不小心占到手上注意立即冲洗。 DEPC毒性并不是很强，但吸入的毒性是最强的，使用时戴口罩。 高压蒸汽灭菌 121，25min 后，DEPC分解成二氧化碳和酒精。,（2）抑制内源的RNase的活性： 常用的抑制RNase的试剂有： 异硫氰酸胍：强烈变性剂，能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎，使RNA从细胞中释放。 -巯基乙醇和异硫氰酸胍能使细胞内各种RNA酶失活。 十二烷基肌酸钠：使核糖体蛋白质与RNA分离。 RNasin：RNA酶的一种非竞争性抑制剂，反转录实验常用。,RNA的保存： 实际操作中，RNA提取并检验