苯唑西林耐药金黄色葡萄球分子流行病学调查及糖肽类抗生素对葡萄球菌体外活性研究ppt课件

1、.,1,苯唑西林耐药金黄色葡萄球分子流行病学调查及糖肽类抗生素对葡萄球菌体外活性研究,孙宏莉 王 辉 陈民钧,.,2,研究背景,3,.,Evolution of Drug Resistance in S. aureus,S. aureus,Penicillin,1944,Penicillin-resistant S. aureus,Methicillin,1962,Methicillin-resistant S. aureus (MRSA),Vancomycin-resistant enterococci (VRE),Vancomycin,1990s,1997,Vancomycin inter

2、mediate S. aureus (VISA),2002,Vancomycin- resistant S. aureus,CDC, MMWR 2002;51(26):565-567,研究背景,4,.,苯唑西林耐药的金黄色葡萄球（MRSA）是引起医院感染的主要病因，常发生于免疫力低下的住院患者。 世界首例MRSA ：1961年，英国 目前在许多国家仍在增长：,研究背景,.,5,世界约100,000人/年感染MRSA 国疾病控制和预防中心（CDC）统计,研究背景,6,.,欧洲部分国家MRSA发生率比较,%,Tiemersma EW, et al. MRSA in Europe 1999-2002

3、. Emerging infetious Diseases,2004,10(9)1627-1634,研究背景,7,.,1989-2001年美国ICU病房MRSA发病率,美国国家医院感染监测中心（NNIS）提供,研究背景,8,.,2001-2003年协和医院MRSA发生率比较,研究背景,9,.,内酰胺类抗生素对金黄色葡萄球菌的作用机制,青霉素结合蛋白（PBP）是参与细胞壁肽聚糖成分合成的酶。-内酰胺类抗生素能与细菌胞膜的PBP结合使其失活，从而细胞壁合成受到抑制，导致细菌死亡,研究背景,10,.,对内酰胺类抗生素（如苯唑西林）耐药机制： 低水平耐药：产生过量的内酰胺酶、PBPs过量表达、PBP与

4、苯唑西林亲和力下降； 高水平耐药：产生由mecA基因编码的PBP2a，可替代其它PBP合成细胞壁，但与内酰胺类抗生素亲和力差，而产生耐药。 对其它抗生素耐药机制： mecA基因位于一个可移动元件SCCmecDNA，该元件由不同的整合子、转座子等组成，分别编码不同抗生素的耐药基因。,MRSA耐药机制,研究背景,11,.,MRSA治疗上的困难,多重耐药 有效治疗药物：万古霉素、替考拉宁、利萘唑烷、链阳霉素、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑、氯霉素等 已出现对万古霉素敏感性下降的金黄色葡萄球菌：多为MRSA 在住院患者间易传播，造成爆发流行,研究背景,12,.,MRSA耐药性及流行病学研究对于正确治疗其引起的感

5、染、防止其播散有重要意义。,研究意义,.,13,技术路线,14,.,从协和医院2002年住院患者分离212株MRSA（表型测定） MRSA的确证（苯唑西林盐琼脂筛选法 mecA-femB 双重PCR法) ICU、RCU病房的MRSA 耐药性检测 回顾性分子流行病学调查 （琼脂稀释法；抗生素纸片琼脂扩散法） （脉冲场凝胶电泳） 替考拉宁和万古霉素对葡萄球体外活性,技术路线,为临床正确防治并减少MRSA的感染提供参考依据,同源性分析，跟踪爆发流行趋势， 区分新生感染/复发感染、污染菌/病原菌,15,.,MRSA的筛选及耐药性检测,MRSA医院流行病学调查,MRSA感染病例临床资料分析,Part 1

6、,Part 2,Part 3,.,16,第一部分：MRSA的筛选及耐药性检测,17,.,MRSA的表型鉴定,MRSA的确证试验, 平板/PCR,MRSA耐药性检测,药敏结果数据分析及处理,18,.,一、MRSA的表型鉴定,待测菌株 革兰氏染色 触酶试验（） （阳性且呈双、链、葡萄状球菌） 胶乳凝集试验（测凝集因子、蛋白A）（） 疑难菌：API系统和VITEK系统鉴定 苯唑西林药敏试验 （抑菌圈直径 10mm）,19,.,二、MRSA的确证试验,mecAfemB双重PCR法,苯唑西林-盐琼脂筛选法,20,.,苯唑西林盐琼脂筛选试验检测MRSA,方法： （参照NCCLS M100-S13文件中的规

7、定） 待测新鲜菌悬液（0.5号比浊管浊度） 点种于苯唑西林盐琼脂筛选平皿 （含4% NaCl、6g/ml 苯唑西林的M-H平皿 ） 空气，35孵育24-48小时 生长菌落数1 检测结果：212株中有165株金葡菌在筛选平皿生长,MRSA检测,21,.,mecAfemB 双重PCR法检测MRSA（原理及方法）,mecA：编码PBP2a，苯唑西林耐药的决定子。 femB：某些葡萄球菌属染色体辅助基因，编码细胞壁合成所需的一种重要酶。,MRSA检测,22,.,mecAfemB 双重PCR法检测MRSA（原理及方法）,mecA、femB基因在不同种类葡萄球菌中的表达* MRSA MSSA MRSCoN

8、 MSSCoN mecA femB 注：MRSA苯唑西林耐药的金黄色葡萄球菌； MRSCoN苯唑西林耐药的凝固酶阴性葡萄球菌 MSSA苯唑西林敏感的金黄色葡萄球菌； MSSCoN苯唑西林敏感的凝固酶阴性葡萄球菌 * JCM.May 2002,P.1821-1823,MRSA检测,23,.,mecAfemB 双重PCR法检测MRSA（原理及方法）,PCR扩增mecA和femB基因所用引物* 引物名 引物序列 扩增片段长度 MecA1 5-GTA GAA ATG ACT GAA CGT CCG ATA A 3 310bp MecA2 5-CCA ATT CCA CAT TGT TTC GGT CT

9、A A-3 FemB1 5-TTA CAG AGT TAA CTG TTA CC -3 651bp FemB2 5-ATA CAA ATC CAG CAC GCT CT-3 PCR产物310bp、651b处出现荧光条带为阳性 * Eur J Clin Microbiol Infect Dis,1999,18:643-647.,MRSA检测,24,.,mecAfemB 双重PCR法检测MRSA （结果）,165株筛选平皿确证的MRSA经双重PCR法进一步确证，均为MRSA。 M: marker; 16: PCR producs of MRSA; 7: ATCC25923（MSSA）,MRSA检测

10、,M 1 2 3 4 5 6 7,25,.,三、MRSA的耐药性检测（方法）,抗生素纸片琼脂扩散法：万古霉素、替考拉宁、 复方新诺明、四环素 琼脂稀释法：万古霉素、替考拉宁、苯唑西林、庆大霉素、左氧氟沙星、红霉素、氯霉素 参照NCCLS M100-S13文件： 待测菌悬液：0.5号比浊管浊度 药敏培养基：M-H平皿 培养条件： 35，空气，孵育24小时 判读结果： 按NCCLS M100-S13文件规定的标准 数据分析及处理：WHONET-5.3软件,MRSA检测,26,.,MRSA的耐药性检测（结果1）,165种MRSA对9种抗生素的药敏结果：,抗生素 R% I% S% MIC50 MIC9

11、0 MIC值范围,苯唑西林10000646432-64 替考拉宁00100220.5-8 万古霉素00100 0.510.25-2 庆大霉素1000025651232-512 红霉素93.91.84.2128128125-128 氯霉素0.60.698.8884-64 左氧氟沙星98.21.8016324-128 甲氧苄啶3.60.695.8 /磺胺甲恶唑 四环素96.31.22.5,耐药性检测,27,.,MRSA的耐药性检测（结果2）,MIC法测定的万古霉素和替考拉宁对165株MRSA的MICs的散点图,耐药性检测,.,28,第二部分：MRSA医院流行病学调查 （ICU、RCU病房）,29,

12、.,脉冲场凝胶电泳（PFGE）,耐药表型和基因型比较,30,.,一、MRSA的脉冲场凝胶电泳（原理）,PFGE,31,.,MRSA的脉冲场凝胶电泳（结果分型2）,1 2 3 4 5 6 7 8 9 M 10 11 12 13 14,2002年ICU及RCU病房MRSA主要流行株(A1亚型) 114 lanes: A1亚型（共55株）; M: ladder marker,PFGE,32,.,MRSA的脉冲场凝胶电泳（结果判读）,PFGE,CDC Tenover *等人推荐的方法判读：,突变位点数 酶切后DNA片断区别 亲缘关系 基因分型,0 无区别 同型 1 2-3条 亲缘关系密切 同型但不同亚

13、型 2 4-6条 可能存在亲缘关系 同型但不同亚型 3 7条 无亲缘关系 不同型,1. * Tenover FC,JCM,1995,33:2233-2239.,33,.,MRSA的脉冲场凝胶电泳（结果分型1）,5种：A（A1、A2）、B（B1、B2、B3）C、D、E型,ICU及RCU病房65株MRSA 的PFGE图谱,M A1 A2 B1 B1 B2 B2 B3 D D C E M,PFGE,34,.,MRSA部分病例调查结果（三）,A1亚型爆发流行株（55/65株）分离时间遍布2002全年,临床资料,35,.,二、MRSA的耐药表型和基因型比较,不同基因型（不同克隆来源）,相同耐药谱,表型与

14、基因型,36,.,序号 病房 分离时间 标本类型 耐药谱 PFGE分型,1 RCU 2002-2-1 痰 OGLER A1 2 ICU 2002-8-1 痰 OGLER A1 3 ICU 2002-10-3 痰 OGLER A1 4 ICU 2002-10-8 痰 OGLER A1 5 ICU 2002-10-14 痰 OGLER A1 6 ICU 2002-1-2 血液 OGLER A1 7 ICU 2002-1-8 痰 OGLER A1 8 ICU 2002-2-4 痰 OGLER A1 9 ICU 2002-4-8 痰 OGLER A1 10 ICU 2002-4-10 导管 OGLER

15、 A1 11 ICU 2002-10-3 痰 OGLER A2 12 RCU 2002-10-3 痰 OGLER B1 13 RCU 2002-1-14 痰 OGLER B1 14 RCU 2002-6-2 痰 OGLER B2 15 RCU 2002-12-2 痰 OGLER B2 16 ICU 2002-2-5 腹水 OGLER B3 17 RCU 2002-5-10 导尿管 OGLER C 18 RCU 2002-11-10 痰 OGLER D 19 ICU 2002-7-4 痰 OGLER D 20 ICU 2002-3-2 痰 OGLER E,表型与基因型,注：O苯唑西林、G庆大霉素

16、、L左氧氟沙星、E红霉素、R四环素,37,.,MRSA的脉冲场凝胶电泳（结果小结）,ICU和RCU病房2002全年都在流行着A1亚型MRSA。 耐药谱分型与PFGE分型可不一致。,.,38,第三部分：临床资料分析,39,.,本研究MRSA为多重耐药，基因分型同源性高，造成治疗困难。 为找到合理使用抗生素策略及爆发流行源头和传播途径，对部分病例进行了回顾性调查分析，结果发现：,临床资料,40,.,MRSA部分病例调查结果（一）,调查项目 调查结果 疾病 严重感染12/30; 癌症7/30; 多器官功能衰竭6/30; 心、肺、 肾衰各1/30 年龄 20岁以下1/35; 20-40岁4/35; 4

17、0-70岁21/35; 70岁以上9/35 标本来源 痰51/65; 血液4/65; 导尿管3/65; 支气管刷、洁尿各2/65；其它3/65 器械治疗 呼吸机17/30；置管18/30；大手术11/30,临床资料,41,.,MRSA部分病例调查结果（二）,调查项目 调查结果 抗菌素使用史 25/30住院期间使用过第三、四代头孢菌素、氟喹诺酮类、碳青霉烯类等广谱抗生素。 改用万古霉素或替考拉宁后转归 MRSA所致感染好转者占23/29； 未好转者6/29 同一患者不同分离株时间间隔 8/65采集到不止一株MRSA（间隔至少二周，其中一位长达半年）。 MRSA分离时间 2002年1月12月间无明

18、显波动,临床资料,.,42,第四部分：替考拉宁和万古霉素对葡萄球菌,的体外活性检测,.,43,替考拉宁和万古霉素对葡萄球体外活性检测（方法）,测定替考拉宁和万古霉素的MIC及抑菌圈直径 （琼脂稀释法、K-B法）,不同种葡萄球菌 （MRSA、溶血葡萄球菌、表皮葡萄球菌）,不同接种浓度菌液 （104 cfu、106 cfu）,活性区别,对MIC结果的影响,琼脂稀释法与抗生素纸片扩散法药敏结果的相关性,44,.,替考拉宁和万古霉素对葡萄球菌体外活性检测（结果1）,不同接种浓度菌液对二种抗生素外活性影响 二种抗生素对不同葡萄球菌的活性区别,45,.,替考拉宁和万古霉素对葡萄球菌的体外活性检测（结果2）

19、,TEC、VAN对葡萄球菌的MIC法与纸片扩散法之间的相关性,46,.,替考拉宁和万古霉素对葡萄球菌的体外活性检测（结果小结）,.,47,讨 论,48,.,MRSA引起的医院感染与治疗（一）,是医院感染主要病因，常发生抵抗力低下的住院患者。 可引起住院患者的长期感染，不易消除。 爆发流行主要途径： 共用的医疗器械（如呼吸机）、 MRSA携带者 （患者、医护人员等）,讨论,49,.,MRSA引起的医院感染与治疗（二）,抗生素选择压力下的后果。 使用或改用合理抗生素治疗： 多数病人迅速好转； 抗生素治疗无效组：病人身体状况太差，药物很难到达有效部位或到达有效部位的抗生素浓度不足，不能完全杀灭耐药菌

20、。,讨论,50,.,替考拉宁和万古霉素对葡萄球菌的体外抗菌活性,替考拉宁 受多种因素影响： 在琼脂中扩散系数 接种菌量 以K-B法检测的替考拉宁耐药菌株，应进一步测定其MIC。 通常敏感株 金黄色葡萄球菌 不稳定敏感株 凝固酶阴性葡萄球菌（如溶血葡萄球菌）： 细胞膜39kD的蛋白质，阻碍替考拉宁与靶位的结合。 万古霉素 对葡萄球菌活性较稳定，但对肠球菌活性较差。,讨论,51,.,结论,MRSA耐药性特点,万古霉素和替考拉宁高敏100,复方新诺明和氯霉素敏感率较高,其它所测抗生素多重高耐,2002年ICU、RCU病房发生了A1基因型MRSA流行,MRSA流行病学调查,52,.,治疗及预防MRSA感染及爆发流行的关