实验室规则与安全

1、实验室规则与安全,余 蔚,微生物危害程度分级,2020/7/5,2,中食高科微生物与分子实验室,实验室生物安全防护水平BSL（Biosafety Level）分为：I，II，III，IV级，分别以BSL-1，BSL-2，BSL-3，BSL-4表示实验室的生物安全防护水平,生物安全实验室分级,2020/7/5,3,中食高科微生物与分子实验室,生物安全实验室的选择,II级危害常见致病菌的检测，生化鉴定，免疫实验，PCR提取，涂片，显微观察等均需在BSL-2实验室进行。,2020/7/5,4,中食高科微生物与分子实验室,实验室生物安全防护屏障,一级屏障主要包括：各级生物安全柜（用于防护可能生成的含有

2、病原微生物的气溶胶）和个人防护装备 二级屏障主要包括：建筑结构，通风空调，给水排水，电气和控制系统,2020/7/5,5,中食高科微生物与分子实验室,生物安全实验室的硬件要求 BSL-2（基础生物实验室 ）,可共用建筑物，但应有可自动关闭带锁的门，实验室的门应有可视窗 应采用窗户进行自然通风，并应带有防虫纱窗。 应配备有生物安全柜，生物安全柜的作用是防护生成的含有病原生物的气溶胶 实验室门上应标有国际通用的生物危害警告标志。 空气流向：缓冲区-低污染区-严重污染区，每个区之间有-10-60pa的压差，防止空气倒流,2020/7/5,6,中食高科微生物与分子实验室,2020/7/5,7,中食高科

3、微生物与分子实验室,生物安全柜（BSCs）分级,2020/7/5,8,中食高科微生物与分子实验室,不同保护类型及生物安全柜的选择,2020/7/5,9,中食高科微生物与分子实验室,无菌室的硬件要求,墙面及地面应光滑，易于清洁与消毒 入口处应设有缓冲间，缓冲间应有紫外灯消毒，并有自动洗手和干手装置 推荐温度为20，湿度为40%-60% 应配备消毒装置：紫外灯等,2020/7/5,10,中食高科微生物与分子实验室,微生物实验室进入规范,只有经批准的人员方可进入实验室工作区域。 实验室的门应保持关闭。 儿童以及与实验无关的动物不应被批准或允许进入实验室工作区域。,2020/7/5,11,中食高科微生

4、物与分子实验室,无菌室的准备与进入,无菌室使用前必须打开无菌室的紫外灯辐照灭菌30分钟以上，并且同时打开超净台进行吹风 。 进入无菌室前30分钟应关闭紫外灯，以减少紫外线及臭氧对人体的伤害。 进入程序：肥皂（消毒液）洗手换无菌室工作鞋进入缓冲间更换无菌室工作服，带口罩，帽子,2020/7/5,12,中食高科微生物与分子实验室,人员防护,在实验室工作中，任何时候都必须穿着工作服。 在进行可能接触到感染性材料的操作时，必须戴手套，手套使用完毕，应先对手套进行消毒再摘除手套，随后必须洗手。 在处理完感染性材料或离开实验室之前，都必须先洗手。 严禁穿着实验室工作服离开实验室。 禁止在实验室工作区域进食

5、，饮水，化妆，戴隐性眼睛。 禁止在实验室工作区域储存食物和饮料。 实验室工作服和日常服装必须分开放置。,2020/7/5,13,中食高科微生物与分子实验室,无菌室工作结束后的处理,收拾操作台面的废弃物，用容器从传递窗传出。 喷75%酒精（消毒液）消毒操作台面，离开。 进入缓冲间，脱下工作服，口罩，帽子（一次性口罩，帽子应带出丢弃），换鞋,2020/7/5,14,中食高科微生物与分子实验室,废弃物的处理程序,实验室应配备有普通废弃物和污染废弃物两个垃圾箱，在污染废弃物垃圾箱上应有生物危害标志。 废弃物应分类收集：实验室培养物及其污染物应放入污染废弃物垃圾箱内。 废弃物的处理与消毒： 121，30

6、分钟或以上高压蒸汽灭菌，消毒液灭菌，或者高温灭菌。 任何必要的清洗，修复必须在灭菌或消毒处理之后进行,2020/7/5,15,中食高科微生物与分子实验室,实验室的污染清除程序,无菌室： 紫外灯消毒：30min（室内温度20，湿度40%-60%）；30min（室内温度40,湿度60%） 臭氧消毒：20mg/m3浓度的臭氧消毒时间30min 消毒验证：平板计数琼脂平板开盖暴露15min后，转移至36培养48h，计数，要求15cfu,2020/7/5,16,中食高科微生物与分子实验室,实验室的污染清除程序,实验室废弃物： 高压蒸汽灭菌是清除污染的首选方法。 实验室的培养物，感染材料等应先通过高压蒸汽

7、灭菌（121，30min或以上）处理 其他消毒方法：消毒液（70%乙醇，有效氯浓度1g/mL的漂白剂，100mL/L的甲醇等）浸泡，高温消毒等,2020/7/5,17,中食高科微生物与分子实验室,实验室的污染清除程序,生物安全柜： 多聚甲醛（空气中浓度达到0.8%）熏蒸6h，比多聚甲醛浓度高10%的碳酸氢铵蒸发后，接通生物安全柜电源，启动2s，使碳酸氢铵循环,2020/7/5,18,中食高科微生物与分子实验室,实验室的污染清除程序,手部污染： 大部分情况下，用普通的肥皂和水彻底冲洗手部即可清除手部污染，在高度危险的情况下，建议使用杀菌肥皂。 手要完全抹上肥皂，搓洗至少10s，用干净水冲洗后再用

8、干净毛巾或纸巾擦干。 没有条件彻底洗手或洗手不方便，应用70%酒精来清除手部的轻度污染。,2020/7/5,19,中食高科微生物与分子实验室,安全应急程序,刺伤，切割伤或擦伤： 脱下防护服，用肥皂和大量流水冲洗受伤部位，应尽可能挤出伤口处的血液，70%酒精或其他消毒剂消毒伤口，必要时进行医学处理。 潜在危害性气溶胶的释放（生物安全柜外）： 所有人员立即撤离，任何暴露人员都应进行医学咨询，在一定时间内严禁人员进入，应在门口张贴“严禁进入”的标志。过了相应的时间后，应在生物专家的指导下清除污染才可以正常使用。,2020/7/5,20,中食高科微生物与分子实验室,安全应急程序,容器破碎及感染性物质溢

9、出： 应立即用纸巾或者毛巾覆盖在污染物上，随后在其上倒消毒剂，作用30min后，清理掉布，纸巾及破碎物品，破碎玻璃应用镊子处理，处理用的纸巾，毛巾及破碎物品应放入污染废弃物垃圾箱中，经过消毒处理后再丢弃。 所有的操作过程都应戴手套处理。,2020/7/5,21,中食高科微生物与分子实验室,分子生物实验室硬件要求基因检测实验室,分隔的工作区：试剂贮存和准备区，样品粉碎区和准备区，PCR扩增区，扩增产物分析区。 工作区工作服，试剂，仪器等必须有明确的标记，避免混用。 各实验区域应有专用的仪器设备，同一区域内的仪器设备、物品和工作服应有明显标记，避免与其他区域的仪器设备混用。 仪器设备的校准应符合I

10、SO/IEC 17025：1999中5.5的规定。,2020/7/5,22,中食高科微生物与分子实验室,PCR产物分析区,本区是最主要的扩增产物污染来源，应采用负压条件或减压（如排风扇等）条件以减少扩增产物从本区扩散到其他区域。,2020/7/5,23,中食高科微生物与分子实验室,基因检验实验室进入规范,单一方向进入：试剂贮存和准备区样品粉碎区和准备区PCR扩增区扩增产物分析区。 不同区域使用不同颜色工作服，工作服不得带出所在工作区域 送检样品的包装应完好并有明确的标识；在对实验室样品进行混样、测试样品的制备和称量过程中应避免交叉污染,2020/7/5,24,中食高科微生物与分子实验室,实验室

11、的污染清除程序,实验室空间应定期进行紫外照射。 实验台面： 10%次氯酸钠或3%双氧水清洁台面 实验后紫外灯照射实验台面，照射过夜。 实验室的清洁程序应按试剂贮存和准备区样品粉碎区和准备区PCR扩增区扩增产物分析区方向清洁。 含PCR产物的任何废液，或污染了PCR产物的吸头等试验用具，应浸泡于1mol/L的盐酸溶液，清除污染后丢弃。,2020/7/5,25,中食高科微生物与分子实验室,个人防护,在整个实验操作过程中要穿实验服，戴手套。 紫外线：应佩戴具有紫外线防护功能的护目镜和/或防护面罩，并遮蔽暴露的皮肤。,2020/7/5,26,中食高科微生物与分子实验室,实验试剂和危害废弃物管理,具有毒

12、性，放射性，致癌或致突变性的试剂应有明显的标志 使用过的移液器吸头应放入含有10%次氯酸钠溶液的容器内浸泡，浸泡时间不宜少于24 h。 含有PCR产物的所有液体及废弃物应放入含有1 mol/L HCl的容器中浸泡，浸泡时间不宜少于6 h；采用PCR-ELISA方法检测时洗板机洗板所产生的废液应收集至1 mol/L HCl溶液中。 对含有EB或经EB浸泡过的琼脂糖凝胶、电泳缓冲液的处理:KMnO4-NaOH（高浓度），活性炭过滤（低浓度）。 阳性质粒宜放入1 mol/L HCl溶液中浸泡，浸泡时间不宜少于6 h。,2020/7/5,27,中食高科微生物与分子实验室,微生物检验原理,2020/7/

13、5,28,中食高科微生物与分子实验室,菌落总数,食品检样经过处理，在一定条件下（培养温度，培养时间，培养基成分等）培养后，所形成的菌落数。 所得到的是嗜中温，需氧或兼性厌氧菌。 单位：CFU（Colony Forming Units） 检验原理：36平板计数琼脂培养2d,2020/7/5,29,中食高科微生物与分子实验室,大肠菌群,大肠菌群，在36培养2d，能产酸产气的需氧和兼性厌氧的G-无芽孢杆菌 MPN最近似值 检测原理：LST肉汤初发酵，BGLB肉汤验证,2020/7/5,30,中食高科微生物与分子实验室,霉菌和酵母,在孟加拉红培养基上，36培养5d，观察结果 霉菌菌落特征：菌落大、疏松

14、、干燥、不透明，有的呈绒毛状或絮状或网状等，菌体可沿培养基表面蔓延生长，呈现红、黄、绿、青绿、青灰、黑、白、灰等多种颜色。 酵母菌落特征：菌落大而厚，圆形，光滑湿润，粘性，颜色单调。常见白色、土黄色、红色。,2020/7/5,31,中食高科微生物与分子实验室,2020/7/5,32,中食高科微生物与分子实验室,沙门氏菌,检验原理： 前增菌：食品中沙门氏菌含量较少，且常由于食品加工过程使其受到损伤而处于濒死状态，所以对某些加工食品必须经过前增菌处理，使其恢复活力，生鸡蛋和肉类可省略此步骤 选择性增菌：沙门增殖，其他大多数细菌收到抑制。 生化鉴定：借助于三糖铁、靛基质、尿素、KCN、赖氨酸等试验可

15、与肠道其他菌属相鉴别。 血清学鉴定：通过菌种特殊的抗原结构（O抗原为主），可以把他们分辨出来。 步骤：复活（前增菌）培养（选择性增菌）分离（平板划线分离培养）鉴定（生化鉴定/血清鉴定）,2020/7/5,33,中食高科微生物与分子实验室,金黄色葡萄球菌,检验原理7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨蛋白肉汤：金葡耐盐性强适宜生长盐浓度为5%7.5%，10%15%能生长 血平板：金葡可产生溶血素，血平板上生长菌落周围有溶血环。 BP平板，Baird-Parker平板：金葡可产生卵磷脂酶，分解卵磷脂，产生甘油酯和可溶性磷酸胆盐，所以在BP平板上生长菌落为黑色，周围有浑浊带，外层有一透明圈。 金黄色

16、葡萄球菌：黑色菌落，有晕圈和透明环 表皮葡萄球菌：黑色菌落 奇异变形杆菌：褐色菌落 大肠艾希氏菌：被抑制 血凝固酶试验：金葡菌可产生血浆凝固酶，可令血浆中的血浆蛋白酶原变成血浆蛋白酶，使血浆凝固，这是鉴定致病性金葡的重要指标。 步骤：前处理增菌分离镜检生化鉴定,2020/7/5,34,中食高科微生物与分子实验室,志贺氏菌,实验原理样品在GN增菌液中增菌68h后，HE或SS及麦康凯或EMB选择性平板进行分离，三糖铁初步生化试验，半固体培养基动力试验，如三糖铁上：斜面阴性，底层阳性，不产气，硫化氢阴性，无动力，可疑为志贺氏菌。 步骤：增菌分离培养生化鉴定血清学鉴定,2020/7/5,35,中食高科

17、微生物与分子实验室,分子生物学方法在微生物检测中的应用,PCR方法：有普通PCR，荧光PCR，实时荧光PCR（定量PCR）等多种方法。 基因探针法一般也需要增菌，然后加探针试剂杂交，然后在荧光显微镜荧光检测器下获得结果。 PCR方法一般不需增菌太长时间，通过PCR方法对待测微生物的特征片断进行扩增，然后通过凝胶电泳或荧光PCR技术判断结果。,2020/7/5,36,中食高科微生物与分子实验室,分子生物学方法病原菌检测系统的优缺点,分子生物学方法检测致病菌，特异性较强，技术较为前沿，特别是相对国标方面来说。 但国外用户反映其假阳性概率仍然较高，因此只能作为一种初筛方法。 速度方面：仍然需要增菌，

18、一般是第二天出结果，与免疫法比没有速度优势 目前不少产品已经通过AOAC的认证。,2020/7/5,37,中食高科微生物与分子实验室,DNA 探针技术,DNA 探针技术又称分子杂交技术, 是利用DNA分子的变性、复性以及碱基互补配对的高度精确性, 对某一特异性DNA 序列进行探查的新技术。 DNA 探针是利用同位素、生物素等标记的特定DNA 片断, 该片断可大至寄生虫基因组DNA, 小至20 个碱基。当DNA探针与待测的非标记单链DNA( 或RNA) 按碱基顺序互补结合时, 以氢健将2 条单链连接而形成标记DNA- DNA( 或标记DNA- RNA) 的双链杂交分子。将未配对结合的核苷酸溶解后

19、用检测系统( 放射自显影或酶检测等) 检测杂交反应结果。 由于DNA 分子碱基互补的精确性, 单链DNA 探针仅与样品中变性处理的DNA 单链出现配对杂交, 由此决定了探针的特异性;用放射性同位素( 如32P) 或生物素标记探针, 使杂交试验同时具有高度的敏感性。,2020/7/5,38,中食高科微生物与分子实验室,多聚酶链式反应PCR,PCR 的基本原理是在体外对特定的双链DNA 片断进行高效扩增, 故又称基因体外扩增法。首先将靶DNA 双链加热变性为单链, 然后加入两段人工合成的与靶DNA 两端互补的寡核苷酸片断作为引物, 即左端引物和右端引物。该对引物与互补的DNA 单链碱基互补结合后, 在有DNA 聚合酶和4 种dNTPs 底物存在的情况下, 引物沿模板DNA 链按5- 3方向延伸, 自动合成新的DNA 双链。新合成的DNA 双链又可作为扩增的模板, 继续重复以上的DNA 多聚酶链反应。经过2535 次循环, 可将靶DNA 序列扩增近百万倍。PCR技术有快速、特、敏感等特点, 因而该技术在食品微生物检测中具有很大的应用潜力。,2020/7/5,39,中食高科微生物与分子实验室,基因芯片技术,基因芯片技术是上个世纪末诞生的一项新型生物技术。它是将各种基因寡核苷酸点样于芯片表面,微生物样品DNA 经PCR 扩增后制备荧光标记探针, 然后再与芯片上寡核苷酸点杂交, 最