第二十章-重组DNA技术(教学).ppt

1、1,科学出版社案例式教材生物化学课件,重组DNA技术,第二十章,recombinant DNA technique,2,科学出版社案例式教材生物化学课件,基本概念,克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。,获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。,DNA克隆,3,科学出版社案例式教材生物化学课件,基本概念,技术水平：分子克隆(molecular clone) （即DNA 克隆） 细胞克隆 个体克隆（动物或植物）,4,科学出版社案例式教材生物化学课件,基本概念,应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与

2、载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA) 。,DNA克隆,5,科学出版社案例式教材生物化学课件,基本概念,目的： 分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）,基因工程(genetic engineering) 实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。,6,科学出版社案例式教材生物化学课件,自然界DNA重组和基因转移是经常发生的,一、同源重组是最基本的D

3、NA重组方式,二、细菌的基因转移与重组 接合作用 转化作用,三、病毒的作用,7,科学出版社案例式教材生物化学课件,重组DNA技术的发展简史,19601970年重组DNA工具的研究90（载体、酶）。 1972年，Berg 等第一次完成DNA体外重组实验。 1973年，N.Cohen、W.Boyer第一次完成克隆。 1980年，重组胰岛素进入市场。 1985年，Mulis完成PCR技术。 1996年，克隆羊Dolly(1963童第周克隆鱼)。 20世纪90年代启动人类基因组计划。,8,科学出版社案例式教材生物化学课件,第一节 重组DNA技术的基本过程,1.分 2.切 3.接 4.转 5.筛 6.表

4、达,9,科学出版社案例式教材生物化学课件,第二节 重组DNA技术中常用工具酶,科学出版社案例式教材生物化学课件,10,一、限制性核酸内切酶,概念：是一类能识别双链DNA分子中的某些特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶，又称为限制酶。,科学出版社案例式教材生物化学课件,11,（一）限制性核酸内切酶的命名,Hin d,Haemophilus influenzae Rd株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表菌株； 用罗马数字表示发现的先后次序。,科学出版社案例式教材生物化学课件,12,（二）

5、限制性核酸内切酶的类型,型限制性核酸内切酶 型限制性核酸内切酶（应用广泛） 型限制性核酸内切酶 作用 与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA， 保护自身DNA,科学出版社案例式教材生物化学课件,13,（三）型限制性核酸内切酶,特点： 型限制酶识别双链DNA中48个核苷酸组成的特定序列，从其识别序列内切割DNA分子中的磷酸二酯键，产生含5-P和3-OH的产生粘性末端或平末端。,功能： 根据需要在特定的位点精确切割双链DNA分子。,14,科学出版社案例式教材生物化学课件,识别序列特点： 回文结构(palindrome),科学出版社案例式教材生物化学课件,15,（1）产生5 突出粘性末

6、端 (sticky end),科学出版社案例式教材生物化学课件,16,（2）产生3 突出粘性末端,科学出版社案例式教材生物化学课件,17,（3）产生平末端 (blunt end),*GATATC* *CTATAG*,5,3,5,3,18,科学出版社案例式教材生物化学课件,同裂酶（isoschizomer） 又称异源同工酶，指来源不同识别序列相同的酶 同尾酶（isocaudamer） 识别序列与切割位点相互有关的一类酶 可变酶 此类酶是型限制酶的特例，识别DNA序列中的一个或几个碱基是可变的，并且识别序列往往超过6个核苷酸,科学出版社案例式教材生物化学课件,19,(四）限制酶作用的影响因素,DN

7、A底物的纯度 DNA的甲基化程度 DNA分子的结构 酶切反应的温度 酶切反应的时间 酶切反应的缓冲体系,20,科学出版社案例式教材生物化学课件,限制性内切核酸酶,科学出版社案例式教材生物化学课件,21,二、 连接酶(DNA ligase),将两条双链DNA片段连接起来，实现DNA的体外重组,功能：,催化两条双链DNA分子的互补粘性末端或平末端的5 磷酸基团与3 羟基形成磷酸二酯键,22,23,科学出版社案例式教材生物化学课件,24,常用的DNA连接酶,1.大肠杆菌DNA连接酶,2.T4 DNA连接酶,25,科学出版社案例式教材生物化学课件,DNA连接酶对黏性末端的连接效率远高于平末端的连接效率

8、。 连接黏性末端的温度一般在415。 连接酶的用量在平末端连接高于黏末端。 ATP的反应浓度：10mol/L1 mmol/L。 载体与目标基因的摩尔数比值：11013。,影响DNA连接酶作用的因素,科学出版社案例式教材生物化学课件,26,三、DNA聚合酶,能够把脱氧核糖核苷酸连续地添加到双链DNA分子引物链的3-OH末端，催化核苷酸的聚合作用,类型： 大肠杆菌DNA聚合酶 Klenow片段 Taq DNA聚合酶 逆转录酶,科学出版社案例式教材生物化学课件,27,四、其它修饰酶,1.末端脱氧核苷酸转移酶： 主要作用是在外源DNA片段及载体分子的3-OH加上互补的同聚物尾巴，形成人工黏性末端,28

9、,科学出版社案例式教材生物化学课件,29,科学出版社案例式教材生物化学课件,2.多核苷酸激酶： 在重组DNA技术中，多核苷酸激酶可用于标记DNA的5末端，也可使缺失5-P末端的DNA发生磷酸化作用。,30,科学出版社案例式教材生物化学课件,3.碱性磷酸酶： 能特异地切除DNA、RNA和dNTP上5磷酸基团。在重组DNA技术中，用碱性磷酸酶去除载体分子或DNA片段的5-P，以防止发生自身连接。,31,科学出版社案例式教材生物化学课件,32,科学出版社案例式教材生物化学课件,科学出版社案例式教材生物化学课件,33,第三节 重组DNA技术中常用载体,定义 为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的

10、蛋白质所采用的一些DNA分子。,常用载体 质粒DNA 噬菌体DNA 病毒DNA,34,科学出版社案例式教材生物化学课件,克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。,表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成 多肽链而特意设计的载体称为表达载体。,科学出版社案例式教材生物化学课件,35,作为基因工程载体所需具备的基本条件,能自主复制 有多个单一酶切位点，称为多克隆位点（MCS），利于外源DNA分子插入 具有两个以上的选择性遗传标记，便于重组体的筛选和鉴定 分子量小，以容纳较大的外源DNA 拷贝数

11、高 具有较高的遗传稳定性,36,科学出版社案例式教材生物化学课件,一、质粒载体,质粒 (plasmid),特点: 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。,37,科学出版社案例式教材生物化学课件,（一）pBR322质粒载体（克隆6kb）,科学出版社案例式教材生物化学课件,38,（二） pUC19 质粒载体,LacZ基因与-半乳糖苷酶 X-gal，5-溴-4氯-3-吲哚-D-半乳糖苷 MCS区段：来自M13噬菌体,科学出版社案例式教材生物化学课件,39,二、噬菌体（bacteriophage）载体,（一）噬菌体 (phage)载体 （二）粘粒 (cosmid)

12、载体 （三）M13噬菌体载体,科学出版社案例式教材生物化学课件,40,噬菌体插入较大外源DNA片段（23kb）,41,科学出版社案例式教材生物化学课件,与质粒载体相比，其突出优点是可插入较大外源DNA片段 噬菌体的感染效率远高于质粒载体的转化效率,42,科学出版社案例式教材生物化学课件,三、病毒载体,质粒载体、噬菌体载体都是以原核细胞（如大肠杆菌）作为宿主细胞。近年来为适应真核细胞重组DNA技术的需要，特别是为实现真核基因表达或基因治疗的需要，已发展出用动物病毒改造的病毒载体。,43,科学出版社案例式教材生物化学课件,目前常用的病毒载体有整合型和游离型两类 逆转录病毒载体 （整合型） 腺病毒载

13、体 （游离型）,44,科学出版社案例式教材生物化学课件,病毒载体的改造,科学出版社案例式教材生物化学课件,45,三、人工染色体载体,酵母人工染色体载体（YAC）是第一个成功构建的人工染色体载体，用于在酵母细胞中克隆大片段外源DNA。YAC可接受100kb2 000kb的外源DNA片段插入，是人类基因组计划中物理图谱绘制采用的主要载体。,科学出版社案例式教材生物化学课件,46,人工染色体载体包含的调控元件,着丝粒：以保证染色体在细胞分裂过程中正确地分配到子代细胞。 端粒：作为染色体复制所必需的成分，可防止染色体被核酸外切酶降解而缩短。 复制起始点和限制性酶切位点。 YAC载体的两臂均带有选择标记

14、。 原核序列及调控元件：以便于在大肠杆菌中操作。,科学出版社案例式教材生物化学课件,47,第四节 重组DNA技术基本原理,基本原理,科学出版社案例式教材生物化学课件,48,一、目的基因的获得,（一） 化学合成法 （二）聚合酶链反应 (polymerase chain reaction, PCR) （三）从基因文库中筛选,科学出版社案例式教材生物化学课件,49,（一） 化学合成法,要求：已知目的基因的核苷酸序列或其 产物的氨基酸序列,由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列,50,科学出版社案例式教材生物化学课件,（二）聚合酶链反应 PCR法 RT-PCR法（三）从基因文库中筛选 基因组DNA文库

15、(genomic library) cDNA文库 (cDNA library),基因组DNA文库 存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合。,51,科学出版社案例式教材生物化学课件,用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库,52,科学出版社案例式教材生物化学课件,从cDNA文库获取目的基因,53,科学出版社案例式教材生物化学课件,二、克隆载体的选择和构建,目的不同，操作基因的性质不同，载体的选择和改建方法也不同。,科学出版社案例式教材生物化学课件,54,三、目的基因的体外重组,DNA体外重组本质上是一个酶促反应过程，在DNA连接酶的催化作用下，将外源DNA分子（目的基因

16、）与载体DNA分子连接成一个重组分子的过程,55,科学出版社案例式教材生物化学课件,（一）黏性末端连接 （二）平末端连接 （三）人工接头连接 （四）同聚物加尾连接,科学出版社案例式教材生物化学课件,56,（一）黏性末端连接,基本方法： 目的基因与载体分子经同一限制性核酸内切酶切割成具有相同黏性末端的DNA片段后，可通过黏末端互补配对，再借助DNA连接酶封闭缺口，形成完整的重组DNA分子,57,Bam H切割反应,T4 DNA连接酶 15C,同一限制酶切位点连接,58,不同限制酶切位点的连接,科学出版社案例式教材生物化学课件,59,（二）平末端连接,限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成

17、的平端,60,科学出版社案例式教材生物化学课件,62,（三）人工接头连接,由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。,人工接头及其应用,科学出版社案例式教材生物化学课件,64,（四）同聚物加尾连接,在末端转移酶(terminal transferase) 的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。,65,科学出版社案例式教材生物化学课件,66,四、重组DNA分子的导入,宿主细胞应具备的条件 处于感受态 对载体无严格限制 限制酶和重组酶缺陷 不对外源DNA进行修饰 能表达重组体所提供表型特征,67,科学出版社案例式教材生物化学课件,转化

18、转染 感染,科学出版社案例式教材生物化学课件,68,（一）根据重组载体的遗传表型进行筛选 （二）限制性核酸内切酶酶切鉴定 （三）核酸分子杂交法 （四）PCR法 （五）免疫化学检测法,五、重组DNA分子的筛选与鉴定,69,(插入失活法) 抗药性标记选择,70,科学出版社案例式教材生物化学课件,筛选重组体pUC18,71,科学出版社案例式教材生物化学课件,表达体系的建立： 表达载体的构建 受体细胞的建立 表达产物的分离纯化,六、克隆基因的表达,72,科学出版社案例式教材生物化学课件,其优点：简单、迅速、经济、适合大规模生产 。 E.coli表达体系的不足： 不宜表达真核基因组DNA； 不能加工表达的真核蛋白质； 表达的蛋白质常形成不溶性包涵体； 很难表达大量可溶性蛋白。,1. 原核表达体系 (E.coli表达体系最为常用),73,科学出版社案例式教材生物化学课件,优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累 缺点：操作技术难、费时、不经济,2.真核表达体系（酵母、昆虫、乳类动物细胞）,74,科学出版社案例式教材生物化学课件,第五节重组DNA技术与医学 的关系非常密切并前景远大,一、疾病