原料药中杂质和控制及案例分析.ppt

1、原料药中杂质的控制与案例分析,中国药品生物制品检定所 胡昌勤,杂质质控理念的变迁,Impurity Profile （杂质谱）: A description of the identified and unidentified impurities present in a drug substance. 对存在于药品中所有已知杂质和未知杂质的总的描述。,第一次飞跃,第二次飞跃,头孢泊肟酯有关物质分析的HPLC色谱图 1=头孢泊肟，2=去甲氧基头孢泊肟酯异构体A，3=头孢泊肟酯异构体A， 4=去甲氧基头孢泊肟酯异构体B+3异构体，5=头孢泊肟酯异构体B+反式头孢泊肟酯A，6=反式头孢泊肟酯B，

2、7=N-甲酰基头孢泊肟酯异构体A，8=NAC-CPOD-PRX异构体A，9=N-甲酰基头孢泊肟酯异构体B，10=N-乙酰基头孢泊肟酯异构体B，11=头孢泊肟酯开环二聚体A，12=头孢泊肟酯开环二聚体B,杂质谱控制与杂质控制的区别？,杂质谱控制的整体解决方案,原料药杂质控制的相关法规,Q3A： 新原料药中的杂质 Q3B： 新药制剂中的杂质 Q3C： 残留溶剂 化学药品杂质研究的技术指导原则,对新原料药中的杂质如何进行阐述？,化学方面 分类与鉴定 报告 杂质的控制（检查项目、限度） 分析方法 安全性方面 对安全性研究及临床研究中存在的潜在杂质（在当时的实验样品中不存在或含量极低的杂质）的安全性评估

3、,杂质的分类,有机杂质 反应起始物、副产物、中间体、降解产物、试剂、配位体、催化剂等 无机杂质 试剂、配位体、催化剂、重金属、无机盐及过滤介质、活性炭等 残留溶剂 常用的有69种,基本术语,Qualification(界定)：是获得和评价与研发新药相关的杂质的数据的过程，这些数据用于建立新药的安全阈值（水平），单个的或一些已确定的杂质的含量在这个阈值下可以确保药品的生物安全性。 Reporting threshold 或 Reporting level (报告阈值或报告水平）：新药注册时杂质应被报告的限度。 Identified threshold (鉴别阈值）：新药注册时杂质应被鉴别的限度。

4、 Qualificated threshold (界定阈值）：新药注册时杂质应被界定的限度。,新药原料药的杂质限度,（以原料药的响应因子计）,如何合理的对原料药中的杂质进行报告和控制？,研究报告中对有机杂质的基本要求,对新原料药在合成、精制和储存过程中最可能产生的那些实际存在的杂质和潜在的杂质进行综述。 根据合成工艺中化学反应的原理，结合反应条件等，阐述合成工艺中可能产生的副产物； 根据起始原料的结构及来源，阐述可能由起始原料引入的有关物质； 根据起始原料、中间体、产物的结构特点，产生合成中可能产生的降解产物； 根据产物及杂质的结构特点，结合纯化精制工艺，阐述去除杂质的关键工艺。,头孢噻肟钠（

5、Cefotaxime Sodium）杂质的控制,以头孢菌素C为起始物，先经化学或酶催化反应生成7-氨基头孢烯酸（7-ACA），然后进行酰化反应生成头孢噻肟酸（CTAX），最后生成头孢噻肟钠（CTAX-Na）。,头孢菌素的各种可能的降解反应类型,-内酰胺环的降解 氢化噻嗪环的双键异构（-异构）,3. 6、7位氢的反向异构,4. 7位碳相连的侧链反应,分子结构中7位碳侧链上有-氨基的头孢菌素，如头孢氨苄、头孢羟氨苄、头孢拉定、头孢来星、头孢克罗等药物，还可发生分子内亲核反应，生成哌嗪二酮衍生物的降解物,具有苯苷氨酸侧链的-内酰胺抗生素可以降解为2-羟基-3-苯基吡嗪衍生物，这种化合物具有荧光特性，

6、头孢克洛、氯碳头孢均会产生这种降解产物。,5. 发生在R3取代基的反应,当3位碳上的取代基为乙酰氧甲基时，易脱去乙酰基，形成脱乙酰基降解物。在加热、酸性等条件下，可进一步进行分子内部环和，此时生成的主要降解产物为内酯。,6. 双键顺反式异构（E-异构） 7. 酯的水解 8. 聚合反应 9. 其它反应,头孢曲松、头孢噻肟、头孢它啶、头孢地尼等有甲氧亚氨键的头孢菌素均会产生E-异构体，多数在光照的情况易发生此类反应。,基于降解反应的杂质分析,发生在头孢菌素R3取代基的降解反应,当3位碳上的取代基为乙酰氧甲基时，易脱去乙酰基，形成脱乙酰基降解物。在加热、酸性等条件下，可进一步进行分子内部环和，此时生

7、成的主要降解产物为内酯。 杂质B、杂质E可以源于头孢噻肟的降解,杂质谱分析,头孢噻肟有关物质分子结构,头孢噻肟钠的合成工艺,由于起始物头孢菌素C含有DAO-CC、DA-CC和CC-LT等杂质，在半合成步骤中发生相同的反应，分别生成DAO-ACA、DA-ACA和ACA-LT，进而生成DAO-CTAX、DA-CTAX和CTAX-LT等杂质。,杂质E可以源于起始原料 杂质E可以源于合成中的任一中间过程,杂质谱分析,头孢噻肟有关物质典型色谱图（235nm）,杂质谱分析,头孢噻肟有关物质 杂质B含量最大，杂质C含量最低 合成副产物：杂质A、杂质E和杂质G 降解杂质：杂质F,生产工艺中产生的杂质,阐述清楚

8、 产品中可能存在那些杂质 杂质的来源 生产工艺中通过何种手段去除或控制这些杂质的产生 实际产品中这些的杂质水平及变化,加替沙星及其十种杂质对照品的色谱图,加替沙星注射液杂质谱分析,色谱条件：以三乙胺磷酸溶液 三乙胺溶液（1100），用磷酸调节pH值至4.30.05-乙腈（87：13）为流动相，检测波长为325nm，柱温为30，流速为每分钟1ml。,色谱柱:SHISEIDO CAPCELL PAK C18,加替沙星及10个已知杂质的结构式,主要杂质是杂质3和杂质8,生产工艺杂质,原料的杂质谱分析,光照稳定性评价,比较光照前后各杂质含量的变化,按随机取19批样品,UV灯下照射10天,杂质2、杂质4

9、是与光照稳定性密切相关的杂质,大多数喹喏酮类抗生素对光不稳定，什么是光降解杂质？,如何合理的对原料药中的杂质进行报告和控制？,依据合成/降解反应机理，鉴别可能杂质！ 全过程跟踪杂质在合成工艺中的变化！,杂质控制方法,直接测定 色谱法 HPLC TLC HPCE GC 间接测定 溶液的颜色检查,杂质分析方法的选择,方法互补原则 了解不同方法间的相关性 所有的分析方法必须进行验证（validation),药品质控RP-HPLC方法,上市后（仿制）药品 分析方法的有效性 分析方法的最优化 分析方法的耐用性 新药研发 如何确定分离对象,所有的杂质在所选择的RP-HPLC系统中被有效的检出了吗？ 是否有

10、杂质吸附到色谱柱上未被洗脱？ 是否有杂质在色谱柱上未被保留？ 是否所检测到的色谱峰存在共出峰？,新方法,分析方法的有效性（氨苄西林钠/舒巴坦钠）,原方法,中国抗生素杂志，2009，34：734,在对各国药典方法比较的基础上确定分析方法,所有的杂质在所选择的RP-HPLC系统中被有效的检出了吗？ 是否有杂质吸附到色谱柱上未被洗脱？ 是否有杂质在色谱柱上未被保留？ 是否所检测到的色谱峰存在共出峰？,采用HPCE/HPTLC方法 验证RP-HPLC方法的有效性,HPCE分析-内酰胺抗生素杂质谱 最佳分离模式的选择,JCPS，2010，19（4）：285292,头孢菌素有关物质测定中MEKC是HPLC

11、分析的最有效验证方法,MEKC与HPLC测定头孢菌素有关物质的互补性分析,MEKC具有较强的杂质分离能力，但其检测限（LOD）较高。 借助于加速实验，将MEKC分离出的杂质峰数目与HPLC分离出的含量大于MEKC LOD的杂质峰数目进行比较，当两者基本相对时，可以认为HPLC方法具有较满意的分离能力。,药物分析杂志，待发表,HPLC与HPTLC分析庆大霉素的比较,HPTLC中的9号和10号斑点在HPLC中被检出了吗？,庆大霉素供试品HPTLC色谱图 及对应的UV扫描图谱 1.UK1 2.UK2 3.UK3 4.UK4 5.C1a 6.UK5 7.C2a+C2 8.C1,药品质控RP-HPLC方

12、法,上市后（仿制）药品 分析方法的有效性 分析方法的最优化 分析方法的耐用性 新药研发 如何确定分离对象,基于实验设计理念的HPLC方法优化理论,JPBA，2009, 49(5): 11921202,洛伐他定和辛伐他定有关物质HPLC分析方法的优化,新优化出的方法比USP的分离度更好，比EP分离出的杂质峰更多，比ChP所用的分离时间更短，并达到了更好的分离效果,药品质控RP-HPLC方法,上市后（仿制）药品 分析方法的有效性 分析方法的最优化 分析方法的耐用性 新药研发 如何确定分离对象,基于QbD理念的杂质控制策略,JPBA，2008, 46(3):431-441,药物杂质的可能来源,阿奇霉

13、素的合成途经,1.原料：红霉素 A、红霉素 B、红霉素 C、红霉素D、红霉素 E、红霉素 F、 阿奇霉素B、阿奇霉素C、阿奇霉素E、阿奇霉素F 2.中间体：红霉素A肟（Z）、6，9-亚胺醚、氮红霉素A、红霉素A肟（E）、红霉素 C肟（E）、9，11-亚胺醚、红霉素C 6，9-亚胺醚、红霉素A内酰胺 3.副产物：红霉素-N-氧化物、N-去甲基红霉素A、N-去甲基阿奇霉素A、 氨基阿奇霉素A、N-甲酰基-N去甲基阿奇霉素A、N-去甲基-N-苯磺酰基阿奇 霉素、阿奇霉素N-氧化物、3-去（二甲氨基）- 3,4-去氢阿奇霉素、 O-甲苯 磺酰基红霉素肟、红霉素Z肟重排物、氮红霉素11，12-硼酸酯、

14、N，N-去 二甲基N-甲酰基阿奇霉素A、丙基阿奇霉素、3-N， N-去二甲基氨基-酮 基阿奇霉素A、阿奇霉素11，12-硼酸酯 4.降解产物：去克拉克定糖阿奇霉素A、去克拉克定糖氮红霉素、红霉素8， 9-脱水-6，9-半缩酮、红霉素6，9：9，12-螺缩酮,阿奇霉素中可能存在的杂质：37种,模拟色谱图,实际色谱图,采用有效的方法证明杂质不存在， 而不是陈述杂质不存在！,-内酰胺抗生素聚合物的控制,SephadexG-10凝胶色谱系统典型分离图,样品,对照,Kav=0,高效凝胶色谱系统,TSK高效凝胶色谱系统 Superdex pipted 高效凝胶色谱系统 高效疏水凝胶色谱系统,高效疏水凝胶色

15、谱系统,TSK Gel G2500 HXL凝胶柱（填充剂为苯乙烯二乙烯基苯共聚物）3007.8mm i.d; 流动相:含0.26溴化锂的N,N-二甲基甲酰胺溶液； 流速0.4ml/min; 检测波长为280nm。,-内酰胺抗生素聚合物杂质分析,头孢地嗪钠,头孢呋辛酯,TSKgel G2000HHR,头孢丙烯,TSKgel G2500PWXL,法罗培南,TSKgel G2000HHR,TSKgel G2000SWXL,TSKgel G2000SWXL,Sephadex G10 与TSK柱比较,62,G10柱结果与TSK柱结果的相关性,Sephadex G10,TSK,聚合物,其他聚合物,二聚物,

16、头孢噻肟钠聚合物分析,HPLC反相色谱系统控制高分子杂质,通过对指针性杂质的测定，表征药品中高分子杂质总量。,头孢泊肟酯有关物质分析的HPLC色谱图 1=头孢泊肟，2=去甲氧基头孢泊肟酯异构体A，3=头孢泊肟酯异构体A， 4=去甲氧基头孢泊肟酯异构体B+3异构体，5=头孢泊肟酯异构体B+反式头孢泊肟酯A，6=反式头孢泊肟酯B，7=N-甲酰基头孢泊肟酯异构体A，8=NAC-CPOD-PRX异构体A，9=N-甲酰基头孢泊肟酯异构体B，10=N-乙酰基头孢泊肟酯异构体B，11=头孢泊肟酯开环二聚体A，12=头孢泊肟酯开环二聚体B,（A）阿莫西林钠在Superdex Peptide高效凝胶色谱系统中的

17、色谱图 （B）各色谱峰切换到BP有关物质HPLC分析系统后的色谱图,中国新药杂志 ,2008,17(24):23,在溶液中（阿莫西林钠易形成聚合物），阿莫西林闭环二聚体和二酮哌嗪阿莫西林（2S）的含量与各类阿莫西林聚合物含量之和（主峰后杂质总量）呈一定的相关性,中国药学杂志, 2009，44（23）：1821,柱切换技术,反冲模式 (Back flushing mode),柱前富集模式(on-column focusing),盐酸头孢替安聚合物分析方法的比较,Sephadex G-10系统,TSK-Gel G2000swxl系统,柱切换技术,0.8ml/min,TSK系统0.5ml/min,C

18、18系统,对-内酰胺抗生素中的聚合物重点在于研究，证明所采用的工艺是否可能导致样品聚合物变化！ 应采用适宜的方法对-内酰胺抗生素中的聚合物进行控制，而不要仅局限于Sephadex G10系统！,样品中杂质含量的报告,批次及批量 生产日期 生产地点 生产工艺 产品中单个杂质含量及杂质总量 批次用途 使用的分析方法,报告研制过程中所有批次样品的检验结果； 检验结果应用详细记录，而不是简单描述为“符合规定”； 分别记录单个杂质（已知杂质、未知杂质）、总杂质的含量； 所有的杂质应编号，如根据保留时间等 小于1.0%的杂质，表示为两位小数，如0.13%, 0.06% 大于1.0%的杂质，表示为一位少数，

19、如1.3,在新药研发过程中，采用统一的编号系统，表征杂质的变化！,如果新药研发过程中杂质分析方法改变，应分别给出其验证资料并对不同方法的相关性进行评价。 色谱图的相关性比较是必须的。,利用色谱相关光谱法追踪色谱峰不同色谱系统中的位置,杂质数据的积累是制定药品质量标准的重要依据,国内新药研发中对有关物质控制的误区,重指标，轻方法 方法的有效性与样品的现状 对杂质结构的鉴别重视不够,如何确定微量杂质的结构？,根据杂质来源，产生条件，结合母核的质谱裂解规律推断杂质的可能结构,头孢菌素类抗生素质谱裂解的一般规律,青霉素类抗生素质谱裂解的一般规律,鉴定未知同系物结构的策略1,对于具有相同母核的化合物：

20、紫外光谱图可以得到有关母核结构的信息； 一级质谱得到分子量信息； 二级质谱得到碎片峰信息,可以推测出有关各取代基的情况； 利用色谱保留行为来验证推测结果是否正确。,ACA，535：89-99, 2005,分析化学，34（1）：95-99，2006,药学学报，41（5）：475-480，2006,鉴定未知降解杂质结构的策略2,对于反应机理已知的降解杂质： 根据反应原理设计加速实验； 一级质谱得到分子量信息； 二级质谱得到碎片峰信息, 进一步推测降解物的结构； 利用UV特征和色谱保留行为来验证推测结果是否正确。,确定未知杂质的策略3,推测杂质的可能结构 反合成推测的可能杂质 LC/MS通过质谱裂解

21、规律和色谱保留时间确定所推测杂质结构的准确性,微量组分的毒性评价,毒性快速评价平台,斑马鱼毒性快速评价平台，对杂质的胚胎毒性、神经毒性，心脏毒性等进行评价。 优点： 杂质用量少 无需知道杂质结构 实验周期短 （34天一个周期）,Figure 4. Effects of MMTD and TDA on the zebrafish embryonic development (3-dpf). A-D: The embryos treated with MMTD at 10 g/ml (A), 100 g/ml (B), 300 g/ml (C) and at 500 g/ml (D). E-H:

22、the embryos treated with TDA at 100 g/ml (E,F), 300 g/ml (G) and at 500 g/ml (H); I,J: normal embryos as controls at a lateral view (I) and a dorsal view (J). Hemorrhage of brain areas is indicated by white arrow, opaque yolk and YE by red arrow, deficient eyes are by slight-blue arrows, colorless a

23、nd cord-like hearts and enlarged pericardial sacs by yellow arrows, ripple-like notochords by orange arrows.,雌二醇对斑马鱼胚胎的心脏毒性,斑马鱼作为药物耳毒性检测模型,斑马鱼侧线神经丘毛细胞:,(A) 5dpf 幼体头部侧面，示 眼窝上 (SO1 and SO2), 耳囊(O1) 和枕部的 (OC1)的神经丘；(B) O1神经丘毛细胞双染色FM 1-43(红) 和 Yo-Pro-1 (绿). (C) FM 1-43染色； (D). Yo-Pro-1 染色。 Scale bar = 50

24、 um (A); 10 um (BD).,Hearing Research 213 (2006) 2533,药物耳毒性检测 利用一种特殊染料对斑马鱼幼体头部耳蜗区神经丘毛细胞的染色，检测毛细胞的存活状态，来判断检测物的耳毒性。 下图中红色圈示耳蜗区域；给药组中红色箭头示给药后毛细胞减少，黄色圈示给药后1神经丘消失。,给药后,系统对照组（正常幼体）,杂质安全性的界定（评估）,申报者应对所制定的质量标准中的杂质限度提供安全性方面的理由。 对于一个通过充分的安全性研究和临床研究的新原料药，其中任何一个杂质的水平被认为是已经经过评价的； 对于与动物和/或人体内的重要代谢物结构相同的杂质，被认为是经过评价的； 杂质的实际含量如果低于杂质的界定阈值，也被认为是合理的。,对结构已知但含量大于界定限的杂质； 结构未知且含量大于鉴别限的杂质， 如对杂质的安全性不确定，均需要对杂质进行界定。,头孢西酮钠杂质限度的评估,头孢西酮钠杂质限度定为“MMTD不得过1.0%，其它最大杂质不得过2.0%，杂质总量不得过