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文档简介
1、a,1,1,3-丙二醇新基因工程菌的构建,生物技术1101类李娟,a,2,1,3。丙二醇是目前国际公认的六大石化新产品之一,其主要功能被用作聚酯、聚醚和聚氨酯合成体。1,3,1丙二醇的生产方法有化学合成法和微生物变形法,但在自然中选择的微生物厌氧发酵甘油l,3,1丙二醇还存在生产周期和转化率低等问题,目前只有化学合成法用于工业生产。因此,利用基因工程技术构建高产菌株被认为是今后的发展方向。1,3。丙二醇简介,a,3,1,3-丙二醇特性,物理特性:1,3。丙二醇(1,3-丙二醇,l,3-PD)是一种无色无味的透明液体,溶于水、乙醇、醚和甲酰胺,氯仿和苯3j,相对密度1.053 g/cm327,沸
2、点为211,自燃温度为400 。化学性质:高温下羧酸盐合成,异氰酸酯和酸性氯化物生成聚氨酯。1.3丙二醇最重要的特性是根据与离散的反应生成聚酯和聚氨酯。a,4,1,3-丙烷二醇可直接用于防冻剂,是多种增塑剂、洗涤剂、防腐剂和乳化剂的合成原料;在食品、化妆品、制药等行业14j也广泛使用。1,3 .丙二醇的主要用途是合成新聚酯PTT的原料。PTT纤维克服了PET纤维,得到了纤维材料行业的关注,可以作为生产地毯、订书钉和长丝产品、薄膜、非织造布和单丝生产、热塑性工程塑料、a、5、1、3-丙烷二醇基因工程菌的建设预期目标,本研究首先使用PCR方法从大肠杆菌中复制1.16 kb 1,3丙二醇氧化还原酶i
3、soenzyme的编码基因yqhD2.80kb Klebsiella甘油脱水酶衍生的编码基因dhba构建重组细菌I jm109 (petac-DHA-tac-yqhd),构建重组载体pUC.tac.dhaT,大肠杆菌JMl09提供了增加丙二醇生产的新方法。a,6,1,3-丙二醇基因工程菌的构建途径,(1) Klebsiella (Klebsiella)中编码油脱水酶的基因dhaB和大肠杆菌(1,3-丙烷丙二醇氧化调查甘油变形的能力。(2)由PCR扩增1,3,1丙二醇氧化还原酶dhaT,构建重组载体pUC.tac 1注释,构建重组质粒petac-DHA-tac-yqhd和puc-tac-dhat
4、,大肠杆菌(3)在摇瓶级别,已经做好的1,3。丙二醇重组菌EcoliJMl09发酵条件的初步研究,a,7,1,3。丙二醇生物合成途径l,3天丙二醇是其他有机基质厌氧转化中可能发现的典型甘油发酵产物。唯一的碳源、能量源甘油是氧化和还原途径上的歧化,氧化途径产物与碳水化合物发酵产物一致,生产牛的排长所需的ATP,在特定产物形成期间还原力NADH释放;还原途径在氧化途径中消耗过多的还原力,产生1,3,1丙二醇。a,8,1,大肠杆菌JMl09的构建和表达,a,9,1,菌株,质粒和基因片段:大肠杆菌JMl09,质粒pUCl9,PPSYqhD和dhaB基因分别在大肠杆菌和Klebsiella中克隆。2、主
5、要试剂:质粒少量提取套件,粘合剂回收套件;工具酶,抗生素;丙烯酰胺、叉双丙烯酰胺、材料、a,10、(a)、质粒DNA提取(1) LB培养基中重组大肠杆菌的环,振动培养通宵。(2)从Eppendorf管中取出1.5毫升菌液,6000r/min离心5分钟。(3)扔掉上等液,添加溶液I 100 l中等菌体。(4)加入溶液ii 150 l,轻轻搅拌。(5)加入溶液III 150,反向混合,8000 r/min,离心10min。(6)将420L组合缓冲液添加到离心吸附柱中,然后将第5阶段的顶板放入离心吸附柱中搅拌。a,11,6000r/min离心30s。废弃废液回收管的废液。(7)将此漂洗液添加到离心力
6、吸附柱中,静置1分钟后,6000r/min离心力30s。废弃废液回收管的废液。重复一次。倒入废液后。再次从6000 r/min离心2min,并尽可能去除冲洗缓冲液。(8)小心卸下离心吸附柱,安装在干净的1.5ml eppendorf离心管内,添加适量的洗脱缓冲液。在此情况下,一般50,在室温下放置2.5分钟,然后6000 r/2min离心分离2分钟。(9)5”l酶切术后电泳鉴定。a,12,(b),大肠杆菌受体细胞的制造(1)接种EcoliJM109 LB培养基中的隔夜振动培养。(2)在50mLLB培养基中,将0.5mL培养液振动到37 ,培养成od值o.3-0.4。(3)将菌液三角瓶放入冰水中
7、,轻轻摇动,使菌液快速冷却约10分钟。(4)从化妆水到Eppendorf管(1.5毫升),Eppendorf管在冰水中迅速静置15分钟。(5)深入8000r/min离心5min后,静置2分钟,在冰水中迅速采取熟睡,并轻轻吹入预冷的CaCl2400uL,a,13,将悬浮液放入冰水中30分钟左右。重复步骤(6)(5)两次。(7)卸下8000r/min离心5min,然后静置2分钟。快速沉入冰水,添加预冷的CaCl280uL。还可以添加40%的甘油保留替代物。a,14,(3),大肠杆菌转化,(1)去除受体细胞,将其溶解在冰水中。(2)放入要转换的DNA,用吸头轻轻搅拌。不能使用旋涡混合器。(3)冰池4
8、0分钟。(4)42热冲击90s。(5)加入1mlb培养基,37冲击培养1.2 h. (6)涂上含有相应抗生素的lb板。a,15,(4),大肠杆菌JMl09基因工程菌的构建,首先将来自大肠杆菌的基因片段yqhD连接到载体pEtac,重组质粒pEtac-yqhD,酶切,连接到载体pUCl9的tac-yqqhd将重组表达载体酶分解到pEtac,获得大肠杆菌JM 109 (petac-DHA b-tac-yqhd)的双启动子重组表达。a,16,(5),酶活性测定,1,甘油脱水酶活性测定2,1,3天丙二醇氧化还原酶同工酶的酶活性测定,a,17,(6),1,3。丙二醇含量的测定,发酵液中l,3:丙二醇和甘
9、油含量的测定,国内聚合物微gdx。401 (110颈部)。柱温度:250,注入温度:240,传感温度t 240,氮气作为载体气体,注入5 l,1,3。丙烷二醇的保留时间约为2.7分钟,发酵液中1,3 1-丙烷二醇的含量用外部标准方法计算。a,18,2,重组质粒puc-tac-dhat的构建及在大肠杆菌JMl09中与petac-DHA-tac-yqhd的表达,a,19,实验材料菌株:质粒pUCl9,pEtac是Klebsiella中dhaT基因的试剂和工具酶:质粒微量提取套件,胶水回收套件,质粒纯化套件工具酶,抗生素公司,华丽的生物;丙烯酰胺、叉双丙烯酰胺、3PCR引物是Klebsiella发表
10、的序列。a,20,primer:3p Cr primer根据Klebsiella发布的序列,将pEtac.dhaTPCR的设计片段所需的primer:PS:5 -accgcaattgagctagctatgttg 1.3 :引物两端均为l,KmfeI,HindlII消化部位。a,21,实验条件和方法PCR反应系统和反应条件:PCR反应系统:0 5 mL Eppendorf管中依次添加以下试剂:10buffer 5 m,2 5mol/LD NTP 4 lll,MgCl24IlI,上行引物1.3丙二醇氧化还原酶dhaT反应条件:94 预改性5min:改性90 s,54 退火l 5min,72 扩展l
11、 5rain,循环35次;在72 保温10分钟。a,22,(1)大肠杆菌基因工程菌的构建将获得通过将Klebsiella的基因片段dhapost连接到载体pEtae而获得的重组质粒petac-dhaT。Tac-dhaT片段由连接pUCl9获得的重组质粒pUC-tac-dhaT获得。基因工程菌pUC-tae-dhaT和基因工程pEtac-dhaB-tac-yqhD同时转化大肠杆菌KcoliJMl09。(2) 1,3。丙二醇氧化还原酶的酶活性测定1,3-丙二醇氧化还原酶的酶活性。酶活性测定根据250C条件下NAD还原为NADH的速度进行量化。酶活性单位定义为1国际单位(1u),等于还原1lJmol
12、基NAD或生成1 raol产品NADH的每个酶量。a,23,4,重组菌coli jml09 (petac-DHA-tac-yqhd,puc-tac-dhat)发酵培养基优化,a,24,菌株:培养基和培养条件LB培养基:在需要时将胃蛋白酶10、酵母膏5、氯化钠lO、琼脂15(固体培养基)、固体和液体培养基添加到氨苄西林(100) TG/ml、卡那霉素50p.g/ml中种子徽章:使用LB徽章。发酵培养基(g/l):甘油、酵母膏、KH2P04、MgS047H20和维生素B12青霉素100 ixg/ml、卡那霉素50rtg/ml。材料,a,25,摇瓶发酵:在新鲜LB培养基坡度下,选择菌株为50 mL摇
13、瓶(装10mL),从旋转摇床中获取37,150 r/min培养18 h的种子液。接种250mL shaicker病,在150 r/min旋转shaicker上领先37。c培养中,OD600诱导o.7,37 的一定时间发酵。方法,a,26,1,甘油,酵母膏,KH2P04,VBl2,m孤等浓度为重组细菌e coli jml 09(pUC-tac-dhaT-tac-yqhd,pUC-)发酵培养基的基本组成为甘油20g/l、VBL 20.01 g/l、KH2P047.5edL、m92 0.67 g/l和酵母奶油5l,该培养基中l、3 1丙二醇的产量为2.25l。摘要,a,27,2,重组菌e coli jml 09 (petac-dha.tac-yqhd,puc-tac-dhat)的发酵培养基为甘油20g/l,VB L2 o.01g最佳发酵条件为液量10%,接种量10%,速度150 r/min,接种后4d,左右IPTG,IPTG最终浓度l mmol/l。这个徽章l,3。丙二醇的产率为2.432 g/L,a,28,3,重组菌ecol I jml 09 (petae-dha.tac-yqhd)和e coli jml 09(petac . dhb . tac-tac),在正交试验优化的培养基中丙二醇的产率分别为0.3
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