基因工程工程菌构建.ppt

1、a，1，1，3-丙二醇新基因工程菌的构建，生物技术1101类李娟，a，2，1，3。丙二醇是目前国际公认的六大石化新产品之一，其主要功能被用作聚酯、聚醚和聚氨酯合成体。1，3，1丙二醇的生产方法有化学合成法和微生物变形法，但在自然中选择的微生物厌氧发酵甘油l，3，1丙二醇还存在生产周期和转化率低等问题，目前只有化学合成法用于工业生产。因此，利用基因工程技术构建高产菌株被认为是今后的发展方向。1，3。丙二醇简介，a，3，1，3-丙二醇特性，物理特性：1，3。丙二醇(1，3-丙二醇，l，3-PD)是一种无色无味的透明液体，溶于水、乙醇、醚和甲酰胺，氯仿和苯3j，相对密度1.053 g/cm327，沸

2、点为211，自燃温度为400 。化学性质：高温下羧酸盐合成，异氰酸酯和酸性氯化物生成聚氨酯。1.3丙二醇最重要的特性是根据与离散的反应生成聚酯和聚氨酯。a，4，1，3-丙烷二醇可直接用于防冻剂，是多种增塑剂、洗涤剂、防腐剂和乳化剂的合成原料；在食品、化妆品、制药等行业14j也广泛使用。1，3 .丙二醇的主要用途是合成新聚酯PTT的原料。PTT纤维克服了PET纤维，得到了纤维材料行业的关注，可以作为生产地毯、订书钉和长丝产品、薄膜、非织造布和单丝生产、热塑性工程塑料、a、5、1、3-丙烷二醇基因工程菌的建设预期目标，本研究首先使用PCR方法从大肠杆菌中复制1.16 kb 1，3丙二醇氧化还原酶i

3、soenzyme的编码基因yqhD2.80kb Klebsiella甘油脱水酶衍生的编码基因dhba构建重组细菌I jm109 (petac-DHA-tac-yqhd)，构建重组载体pUC.tac.dhaT，大肠杆菌JMl09提供了增加丙二醇生产的新方法。a，6，1，3-丙二醇基因工程菌的构建途径，(1) Klebsiella (Klebsiella)中编码油脱水酶的基因dhaB和大肠杆菌(1，3-丙烷丙二醇氧化调查甘油变形的能力。(2)由PCR扩增1，3，1丙二醇氧化还原酶dhaT，构建重组载体pUC.tac 1注释，构建重组质粒petac-DHA-tac-yqhd和puc-tac-dhat

4、，大肠杆菌(3)在摇瓶级别，已经做好的1，3。丙二醇重组菌EcoliJMl09发酵条件的初步研究，a，7，1，3。丙二醇生物合成途径l，3天丙二醇是其他有机基质厌氧转化中可能发现的典型甘油发酵产物。唯一的碳源、能量源甘油是氧化和还原途径上的歧化，氧化途径产物与碳水化合物发酵产物一致，生产牛的排长所需的ATP，在特定产物形成期间还原力NADH释放；还原途径在氧化途径中消耗过多的还原力，产生1，3，1丙二醇。a，8，1，大肠杆菌JMl09的构建和表达，a，9，1，菌株，质粒和基因片段：大肠杆菌JMl09，质粒pUCl9，PPSYqhD和dhaB基因分别在大肠杆菌和Klebsiella中克隆。2、主

5、要试剂：质粒少量提取套件，粘合剂回收套件；工具酶，抗生素；丙烯酰胺、叉双丙烯酰胺、材料、a，10、(a)、质粒DNA提取(1) LB培养基中重组大肠杆菌的环，振动培养通宵。(2)从Eppendorf管中取出1.5毫升菌液，6000r/min离心5分钟。(3)扔掉上等液，添加溶液I 100 l中等菌体。(4)加入溶液ii 150 l，轻轻搅拌。(5)加入溶液III 150，反向混合，8000 r/min，离心10min。(6)将420L组合缓冲液添加到离心吸附柱中，然后将第5阶段的顶板放入离心吸附柱中搅拌。a，11，6000r/min离心30s。废弃废液回收管的废液。(7)将此漂洗液添加到离心力

6、吸附柱中，静置1分钟后，6000r/min离心力30s。废弃废液回收管的废液。重复一次。倒入废液后。再次从6000 r/min离心2min，并尽可能去除冲洗缓冲液。(8)小心卸下离心吸附柱，安装在干净的1.5ml eppendorf离心管内，添加适量的洗脱缓冲液。在此情况下，一般50，在室温下放置2.5分钟，然后6000 r/2min离心分离2分钟。(9)5”l酶切术后电泳鉴定。a，12，(b)，大肠杆菌受体细胞的制造(1)接种EcoliJM109 LB培养基中的隔夜振动培养。(2)在50mLLB培养基中，将0.5mL培养液振动到37 ，培养成od值o.3-0.4。(3)将菌液三角瓶放入冰水中

7、，轻轻摇动，使菌液快速冷却约10分钟。(4)从化妆水到Eppendorf管(1.5毫升)，Eppendorf管在冰水中迅速静置15分钟。(5)深入8000r/min离心5min后，静置2分钟，在冰水中迅速采取熟睡，并轻轻吹入预冷的CaCl2400uL，a，13，将悬浮液放入冰水中30分钟左右。重复步骤(6)(5)两次。(7)卸下8000r/min离心5min，然后静置2分钟。快速沉入冰水，添加预冷的CaCl280uL。还可以添加40%的甘油保留替代物。a，14，(3)，大肠杆菌转化，(1)去除受体细胞，将其溶解在冰水中。(2)放入要转换的DNA，用吸头轻轻搅拌。不能使用旋涡混合器。(3)冰池4

8、0分钟。(4)42热冲击90s。(5)加入1mlb培养基，37冲击培养1.2 h. (6)涂上含有相应抗生素的lb板。a，15，(4)，大肠杆菌JMl09基因工程菌的构建，首先将来自大肠杆菌的基因片段yqhD连接到载体pEtac，重组质粒pEtac-yqhD，酶切，连接到载体pUCl9的tac-yqqhd将重组表达载体酶分解到pEtac，获得大肠杆菌JM 109 (petac-DHA b-tac-yqhd)的双启动子重组表达。a，16，(5)，酶活性测定，1，甘油脱水酶活性测定2，1，3天丙二醇氧化还原酶同工酶的酶活性测定，a，17，(6)，1，3。丙二醇含量的测定，发酵液中l，3:丙二醇和甘

9、油含量的测定，国内聚合物微gdx。401 (110颈部)。柱温度：250，注入温度：240，传感温度t 240，氮气作为载体气体，注入5 l，1，3。丙烷二醇的保留时间约为2.7分钟，发酵液中1，3 1-丙烷二醇的含量用外部标准方法计算。a，18，2，重组质粒puc-tac-dhat的构建及在大肠杆菌JMl09中与petac-DHA-tac-yqhd的表达，a，19，实验材料菌株：质粒pUCl9，pEtac是Klebsiella中dhaT基因的试剂和工具酶：质粒微量提取套件，胶水回收套件，质粒纯化套件工具酶，抗生素公司，华丽的生物；丙烯酰胺、叉双丙烯酰胺、3PCR引物是Klebsiella发表

10、的序列。a，20，primer:3p Cr primer根据Klebsiella发布的序列，将pEtac.dhaTPCR的设计片段所需的primer:PS:5 -accgcaattgagctagctatgttg 1.3 :引物两端均为l，KmfeI，HindlII消化部位。a，21，实验条件和方法PCR反应系统和反应条件：PCR反应系统：0 5 mL Eppendorf管中依次添加以下试剂：10buffer 5 m，2 5mol/LD NTP 4 lll，MgCl24IlI，上行引物1.3丙二醇氧化还原酶dhaT反应条件：94 预改性5min:改性90 s，54 退火l 5min，72 扩展l

11、 5rain，循环35次；在72 保温10分钟。a，22，(1)大肠杆菌基因工程菌的构建将获得通过将Klebsiella的基因片段dhapost连接到载体pEtae而获得的重组质粒petac-dhaT。Tac-dhaT片段由连接pUCl9获得的重组质粒pUC-tac-dhaT获得。基因工程菌pUC-tae-dhaT和基因工程pEtac-dhaB-tac-yqhD同时转化大肠杆菌KcoliJMl09。(2) 1，3。丙二醇氧化还原酶的酶活性测定1，3-丙二醇氧化还原酶的酶活性。酶活性测定根据250C条件下NAD还原为NADH的速度进行量化。酶活性单位定义为1国际单位(1u)，等于还原1lJmol

12、基NAD或生成1 raol产品NADH的每个酶量。a，23，4，重组菌coli jml09 (petac-DHA-tac-yqhd，puc-tac-dhat)发酵培养基优化，a，24，菌株：培养基和培养条件LB培养基：在需要时将胃蛋白酶10、酵母膏5、氯化钠lO、琼脂15(固体培养基)、固体和液体培养基添加到氨苄西林(100) TG/ml、卡那霉素50p.g/ml中种子徽章：使用LB徽章。发酵培养基(g/l):甘油、酵母膏、KH2P04、MgS047H20和维生素B12青霉素100 ixg/ml、卡那霉素50rtg/ml。材料，a，25，摇瓶发酵：在新鲜LB培养基坡度下，选择菌株为50 mL摇

13、瓶(装10mL)，从旋转摇床中获取37，150 r/min培养18 h的种子液。接种250mL shaicker病，在150 r/min旋转shaicker上领先37。c培养中，OD600诱导o.7，37 的一定时间发酵。方法，a，26，1，甘油，酵母膏，KH2P04，VBl2，m孤等浓度为重组细菌e coli jml 09(pUC-tac-dhaT-tac-yqhd，pUC-)发酵培养基的基本组成为甘油20g/l、VBL 20.01 g/l、KH2P047.5edL、m92 0.67 g/l和酵母奶油5l，该培养基中l、3 1丙二醇的产量为2.25l。摘要，a，27，2，重组菌e coli jml 09 (petac-dha.tac-yqhd，puc-tac-dhat)的发酵培养基为甘油20g/l，VB L2 o.01g最佳发酵条件为液量10%，接种量10%，速度150 r/min，接种后4d，左右IPTG，IPTG最终浓度l mmol/l。这个徽章l，3。丙二醇的产率为2.432 g/L，a，28，3，重组菌ecol I jml 09 (petae-dha.tac-yqhd)和e coli jml 09(petac . dhb . tac-tac)，在正交试验优化的培养基中丙二醇的产率分别为0.3