化学发光免疫分析技术

1、化学发光免疫分析技术,姓名：庞潇卿 专业：生化与分子生物学,目录,发光及化学发光的原理与分类,化学发光剂及其作用原理,化学发光免疫分析的原理与操作,应用与发展前景,发光：是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态（较低能级）跃迁到激发态（较高能级），然后再返回到基态，并释放光子的过程。,基态v0,激发态v,能量,h.v,普朗克公式，能量=h.v h为普朗克常数，v为频率,发光,发光的分类,光照发光,是指发光剂（荧光素）经短波长的入射光照射后，电子吸收能量跃迁到激发态，在其回复至基态时，发射出较长波长的可见光（荧光）。,生物发光,是指发生在生物体内的发光现象。如萤火虫的发光，反应底物为萤火虫荧光素

2、，在荧光素酶的催化下，利用ATP能，生成激发态氧化型荧光素，它在回复基态时多余的能量以光子的形式释放出来。,化学发光,是指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。某些物质（发光剂）在化学反应时吸收了反应过程中的化学能，使反应的产物分子或中间态分子中的电子跃迁到激发态，当电子从激发态回复到基态时，以发射光子的形式释放出能量的现象。,根据形成激发态分子的能量来源不同可分为:,间接化学发光,直接化学发光,化学发光,A + B C* C* C + h.v,A + B C* C* + D C + D* D* D + h.v,化学发光的原理,化学发光的分类,酶促化学发光： 辣根过氧化物酶-鲁米诺（HRP-L

3、uminol）系统 碱性磷酸酶（ALP）系统 黄嘌呤氧化酶系统 非酶促化学发光： 吖啶酯系统 草酸酯系统,闪光（Flash）：,发光时间在数秒内，如吖啶酯,辉光（Glow）：,发光时间在数十分钟以上，如： HRP-Luminol系统 二氧杂环乙烷AP发光（AP-AMPPD）系统 黄嘌呤氧化酶系统,按化学反应类型,按发光持续时间,在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物，称为化学发光剂或发光底物。可分为直接化学发光剂和酶促反应发光剂。,化学发光剂,能作为化学发光剂的条件： 发光的量子产率高； 它的物理-化学特性要与被标记或测定的 物质相匹配； 能与抗原或抗体形成稳定的偶

4、联结合物； 其化学发光常是氧化反应的结果； 在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性。,直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需要酶的催化作用，直接参与发光反应，它们在化学结构上有产生发光的特有基团，可直接标记抗原或抗体。,（一）直接化学发光剂,1. 吖啶酯 2. 三联吡啶钌,吖啶酯 在碱性条件下被H2O2氧化时，发出波长为470 nm的光，具有很高的发光效率，其激发态产物 N-甲基吖啶酮是该发光反应体系的发光体。,Page 11,利用标记酶的催化作用，使发光剂（底物）发光，这一类需酶催化后发光的发光剂称为酶促反应发光剂。,（二） 酶促反应发光剂：,1. 鲁米诺 2. AMPPD,鲁米诺（Lumin

5、ol）发光原理,辣根过氧化酶,文字内容,鲁米诺（Luminol）增强发光反应原理,双负离子,铁氰化钾催化H2O2产生O2,3-氨基-邻苯二甲酸 （激发态）,过氧化物不稳定，分解产生N2,化学发光免疫分析(Chemiluminescence immunoass- ay,CLIA)，是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。是继放射免疫分析、酶免疫分析、荧光免疫分析和胶体时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项新的免疫分析技术。,化学发光免疫分析,一、直接化学发光免疫分析,用吖啶酯直接标记抗体（抗原），与

6、待测标本中相应的抗原（抗体）发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-吖啶酯标记抗体复合物，这时只需加入氧化剂（H2O2）和NaOH使成碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光 。 由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生的光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成正比，可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。,直接化学发光的机理,- 夹心法,磁微粒模式图,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,特点 抗原和抗体结合与未结合部分的易分离,磁微粒技术,磁性纳米粒子与无机或有机分子结合形成的可均匀分散于一定基液中具有高度稳定性的胶态复合材料,二、化学发光酶免疫分析,化学发光酶免疫分

7、析（Chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）是用参与催化某一化学发光反应的酶如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（ALP）来标记抗原或抗体，在与待测标本中相应的抗原（抗体）发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入底物（发光剂），酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。,此处添加内容,该分析系统采用辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体（或抗原），在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗

8、原-酶（HRP）标记抗体复合物，这时加入鲁米诺发光剂、H2O2和化学发光增强剂使产生化学发光。,辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析,辣根过氧化物酶标记化学发光免疫分析示意图,待测样品,标记抗体或抗原（磁颗粒）,在磁场中洗涤去除未结合的反应物,发光底物,仪器检测,包被抗体或抗原的反应管,反应30-60分钟,反应0-5分钟,基本操作步骤,化学发光免疫分析仪,优点,1.灵敏度高 ：CLIA关键的优越性，其灵敏度可达10-16mol/L(RIA为10-12mol/L) 。 2.宽的线性动力学范围 ：发光强度在46个量级之间与测定物质浓度间呈线性关系。 3.光信号持续时间长 ：辉光型的CLIA产生的光

9、信号持续时间可达数小时甚至一天，简化了实验操作及测量。 4.分析方法简便快速 ：绝大多数分析测定均为仅需加入一种试剂（或复合试剂）的一步模式。 5.结果稳定、误差小：样品系直接自己发光，不需要任何光源照射，分析结果灵敏稳定可靠 6.安全性好及使用期长 ：免除了使用放射性物质。,单光子计数器,光电倍增管,高压,高速放大器,高速比较器,高速分频器,发光样品 产生光子,激发光阴极 产生光电子,在阳极上形成较强信号,脉冲信号,相对发光单位 数字脉冲(RLU),在各打拿极之间得到 能量和数目的倍增,化学发光免疫分析仪核心部件,化学发光免疫分析的应用（一）,肺结核病常以人体血清中CA125 含量为疾病标记

10、物，Wang 等建立了CA125 的毛细管化学发光免疫分析方法，以实现对肺结核病的检测。 Knight 等采用化学发光免疫夹心分析方法对梅毒病毒进行检测，并与传统的分析方法快速血浆素反应（RPR）和酶免疫分析方法（ELI SA）进行比较，通过对多种样品进行检测，并与RPR 及ELISA分析方法结果相比有 99.1的正确率。 甲胎蛋白（AFP）为肿瘤疾病标志物，Zhang 等利用磁性微粒子和包被小管建立了AFP 的化学发光酶免疫分析方法。在该方法中，AFP抗体首先包被于两种不同的固相载体上，如磁性微粒子和包被小管，再分别对这两种包被模式建立的化学发光免疫分析方法进行比较。通过再抗体包被浓度、标记

11、于抗体上HRP 的稀释比例、分析所需时间、化学发光动力学等角度进行衡量，显示磁性微粒子具有较大的优势。,医学检测,化学发光免疫分析的应用（二）,Quan 等建立了食品中伏马菌素B1 的化学发光酶免疫分析方法，与伏马菌素B1 的 ELISA 方法相比，其方法灵敏度提高了10 倍。且通过样品的添加回收率试验表明其有良好的回收率，其分析结果与ELISA 分析方法与 HPLC 方法有良好的相关性。 Yang 等建立了食品中葡萄球菌肠毒素B（SEB）的碳纳米管的化学发光免疫分析方法，通过将SEB 抗体吸附在碳纳米管表面 ，然后将抗体碳纳米管固定在聚碳酸酯表面，再通过增强化学发光免疫法测定SEB 含量。

12、Magliulo 等建立了牛奶中黄曲霉毒素M1的化学发光酶免疫分析方法，通过将黄曲霉毒素M牛血清白蛋白包被在聚丙烯板上，通过酶标二抗在含有鲁米诺的基板上进行检测。 Lin 等建立了农产品中黄曲霉毒素B1 的化学发光免疫分析方法。同时， 将建立的分析方法与黄曲霉毒素商品化酶联免疫试剂盒进行了相关性试验，相关系数为0.9098，显示其有较好的应用前景。,食品安全检测,化学发光免疫分析的应用（三）,Christian 等通过化学发光酶免疫分析方法建立了环境内分泌干扰物炔雌醇的免疫分析方法，并通过建立的分析方法对表面水和污水处理厂的污水中的炔雌醇进行测定。 Pittman 等通过磁性小珠和生物素-亲和

13、素为载体建立了水样和土样中2，4，6-三硝基甲苯的免疫夹心电化学发光免疫分析方法。 Zhao 等通过建立微板式磁化学发光酶免疫分析方法来对水样中17 -雌二醇进行检测。通过微板磁性分离器可避免前处理过程以达到高通量分析，再结合高灵敏度的化学发光体系，建立了该方法。,环境科学,发展与展望,化学发光免疫分析法具有选择性好、灵敏度高、分析速度快、设备简单等优点，近年来在环境、临床、食品、药物检测中得到了广泛运用。实际检测常常需要对大量、复杂、低丰度的样品进行测定，因而化学发光免疫分析法逐渐向快速、高通量、高灵敏检测的方向发展。 化学发光成像技术、化学发光免疫分析与分离技术的联用，可以使免疫分析的选择性、灵敏度、检测速度和检测通量得到进一步提高。为了更好地适应临床、环境等领域的实际应用，需要大力发展微型化、集成化和自动化的化学发光免疫分析仪器。随着分子生物学及纳米与传感技术的进步，新的化学发光免疫分析原理与高灵敏的免疫分析方法将得到不断发展，开发催化活性更高、稳定性更好、发光动力学曲线更符合免疫分析的酶和底物并推广到临床检测，发展新型标记技术用于信号放大，建立化学发光免疫分析新方法，都将是未来的发展方向及研究重点。,发展与展望,目前化学发光免疫分析方法的发展趋势主要表现在： （