半定量RT-PCR的实验原理和方法步骤

1、半定量逆转录聚合酶链反应的实验原理和方法步骤以下实验步骤仅供参考：1样品核糖核酸的提取取冷冻溶解的细胞，在室温下放置5分钟，使其完全溶解。(2)两相分离将0.2毫升氯仿加入到用1毫升TRIZOL试剂溶解的样品中，并将管盖紧紧地关闭。手动用力摇动试管15秒后，在15至30孵育。持续2到3分钟。在4下以12000转/分钟的速度离心15分钟。离心后，混合液将分为下层红色苯酚氯仿相、中间层和上层无色水相。核糖核酸完全分布在水相中。水相上层的体积约为均质化过程中加入的三唑试剂的60%。(3)核糖核酸沉淀将上层水相转移到没有核糖核酸酶的干净离心管中。加入等体积的异丙醇混合以沉淀其中的核糖核酸，混合均匀后，

2、将核糖核酸在15-30下孵育10分钟，然后在4下以12000转/分钟的速度离心10分钟。此时，离心前不可见的核糖核酸沉淀将在试管的底部和侧壁形成胶体沉淀。(4)洗涤核糖核酸以除去上清液，向每1毫升用三唑试剂溶解的样品中加入至少1毫升75%乙醇(用DEPCH2O制备的75%乙醇)，洗涤核糖核酸沉淀。混合后，在4下以7000rpm离心5分钟。(5)干燥核糖核酸，小心吸走大部分乙醇溶液，在室温空气中干燥核糖核酸沉淀5-10分钟。当溶解核糖核酸沉淀溶解核糖核酸时，加入40l不含核糖核酸酶的水，用枪反复吹几次使其完全溶解。将获得的核糖核酸溶液储存在-80以备后用。2核糖核酸质量检测1)紫外吸收法测定首先

3、，使用稀释的TE溶液将分光光度计归零。然后用TE (1:100)稀释少量的核糖核酸溶液，在分光光度计上读取其在260纳米和280纳米的吸收值，并测量核糖核酸溶液的浓度和纯度。浓度的测定A260较低的读数值1表示40克核糖核酸/毫升。计算样品中核糖核酸浓度(克/毫升)的公式是：A260稀释倍数为40克/毫升。计算如下：将核糖核酸溶于40升DEPC水中，用5ul和1:100稀释至495升。测量A260=0.21。核糖核酸浓度=0.21 100 40克/毫升=840克/毫升或0.84克/升取5ul进行测量后，剩余样品的核糖核酸为35 l，剩余核糖核酸的总量为：35升0.84克/升=29.4克(2)纯

4、度测试核酸溶液的A260/A280的比值为核酸纯度，比值范围为1.8-2.1。2)变性琼脂糖凝胶电泳测定(1)制胶1g琼脂糖溶解在72ml水中，冷却至60c、10毫升10份MOPS电泳缓冲液和18毫升37%甲醛溶液(12.3毫升)。10毫秒电泳缓冲液浓缩成分0.4毫微微秒，酸碱度7.00.1M乙酸钠0.01乙二胺四乙酸倒入凝胶板，保留样品添加孔，并添加至少25升溶液。凝胶化后，取下梳子，将凝胶板放入电泳槽中，加入足够的1摩尔电泳缓冲液，覆盖凝胶表面几毫米。(2)制备核糖核酸样品取3gRNA，加入3倍体积的甲醛样品染料溶液，在甲醛样品染料溶液中加入EB至最终浓度10g/ml。加热至70并保温15

5、分钟以使样品变性。(3)电泳凝胶应在装载前预电泳5分钟，然后将样品加入装载孔。在56V/cm的电压下电泳2h，直到溴酚蓝指示剂凝胶至少为23cm。(4)在紫外透射光下观察和拍照28S和18S核糖体核糖核酸的条带非常明亮和密集(它们的大小取决于用于提取核糖核酸的物种类型)，并且上条带的密度大约是下条带的两倍。还可能观察到由低分子量核糖核酸(t RNA和5S核糖体核糖核酸)组成的较小的轻微扩散带。在18S和28S核糖体带之间，可以看到一种弥漫性EB染色物质，它可能由信使核糖核酸和其他异型核糖核酸组成。如果在核糖核酸制备过程中发生了脱氧核糖核酸污染，它将出现在28S核糖体核糖核酸带上，即较高分子量的

6、扩散迁移物质或带。核糖核酸降解表现为核糖体核糖核酸带的扩散。电泳结果是用数码相机拍摄的。样品3的CDNA合成(1)反应系统反应物剂量序列号1个逆转录缓冲液2l2 upst4待测样品管家基因(-肌动蛋白)的梯度稀释标准和实时定量PCR标准梯度法制备的-肌动蛋白阳性模板浓度为1011。反应前，取3l，稀释10倍(加入27l水，充分混合)至1010，然后依次稀释至109、108、107、106、105和104，备用。(2)反应体系如下：标准反应系统反应物剂量序列号1 SYBR绿色1染料10l2个阳性模板上游引物F0.5l阳性模板下游3个引物R0.5l4dNTP0.5l5Taq酶1l6阳性模板DNA5

7、l7ddH2O32.5l8总体积50l溶液在闪烁管底部混合，并以6000转/分钟的速度短暂离心。巴特勒基因反应系统：反应物剂量序列号1SYBR Green 1染料10l2个内部参考上游引物F0.5l3内部参考下游引物R0.5l4dNTP0.5l5Taq酶1l6个cDNA5l待测样品7ddH2O32.5l8总体积50l溶液在闪烁管底部混合，并以6000转/分钟的速度短暂离心。(3)将制备好的阳性标准品和测试样品同时放在计算机上。反应条件为：93反应2分钟，然后93反应1分钟，55反应2分钟，共40个循环。5绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板的制备(1)对于每个待测基因，选择一个用于确定基因表达的c

8、DNA模板进行聚合酶链反应。反应系统：反应物剂量序列号110聚合酶链反应缓冲液2.5微升2MgCl2溶液1.5微升3上游引物F0.5 ul4下游底漆R0.5 ul5dNTP混合物3升6Taq聚合酶1 ul7cDNA1 ul8加水至总体积25微升溶液在闪烁管底部混合，并以6000转/分钟的速度短暂离心。35个聚合酶链反应循环(941分钟；551分钟；721分钟)；72C延伸5分钟。用2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测扩增产物是否为单一特异性扩增带。(3)对所述聚合酶链式反应产物进行10倍梯度稀释：对所述聚合酶链式反应产物进行10倍梯度稀释：以将所述聚合酶链式反应产物的浓度设定为11010，并

9、将所述聚合酶链式反应产物依次稀释至109、108、107、106、105和104的几个浓度梯度。6待测样品待测基因的实时定量聚合酶链反应所有的cDNA样品分别配置实时定量PCR反应系统。系统配置如下：反应物剂量序列号1SYBR绿色1染料10微升2上游引物1ul3下游底漆1ul4dNTP 1ul5Taq聚合酶2ul要测试的6个cDNA5ul样品7ddH2O 30ul8总体积50微升溶液在闪烁管底部混合，并以6000转/分钟的速度短暂离心。(2)将制备好的聚合酶链反应溶液置于实时聚合酶链反应仪上进行聚合酶链反应扩增反应。反应条件为：93预变性2分钟，然后93预变性1分钟，55预变性1分钟，72预变

10、性1分钟，共40个循环，最后72预变性7分钟。7实时定量聚合酶链反应中使用的引物列表引物Premier 5.0，遵循以下原则：引物和模板序列是紧密互补的；防止在引物和引物之间形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不会在模板的非靶位点引发DNA聚合(即错配)。8电泳每个样品的靶基因和持家基因分别进行实时聚合酶链反应。将聚合酶链反应产物和脱氧核糖核酸梯在2%琼脂糖凝胶上进行电泳，并用GoldView染色，以检测聚合酶链反应产物是否为单一特异性扩增带。逆转录聚合酶链反应结合了以核糖核酸为模板的cDNA合成和聚合酶链反应，为分析基因表达提供了一种快速、灵敏的方法。逆转录聚合酶链反应用于检测或量化表达信息。此外，该技术还可用于检测基因表达差异或克隆cDNA而无需构建cDNA文库。逆转录聚合酶链反应比其他核酸分析技术更灵敏，更容易操作，包括Northern印迹、核糖核酸酶保护分析、原位杂交和S1核酸酶分析。逆转录聚合酶链反应的模板可以是总核糖核酸或多聚腺苷酸选择性核糖核酸。使用逆转录酶，可以用随机