05—酶工程制药

1、第五章 酶工程制药,第一节 概述 第二节 酶的分离纯化 第三节 酶和细胞的固定化 第四节 固定化酶和固定化细胞的反应器 第五节 酶的人工模拟 第六节 酶的化学修饰 第七节 酶工程研究的进展,第五章 酶工程制药,第一节 概 述,酶工程（Enzyme Engineering）是酶学和工程学相互渗透结合、发展而形成的一门新的技术学科。它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异催化性能，并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术。,酶工程简介,酶工程简介,酶工程的名称出现在20世纪20年代，主要指自然酶制剂在工业上的规模应用。 1953年，德国人提出了酶固定化技术 。 1969年，日本人用固定化技术拆分

2、了DL-氨基酸。 1971年，第一届国际酶工程会议提出酶工程的主要内容： 酶的生产、分离纯化、酶的固定化、酶及固定化的反应器、酶和固定化酶的应用。,酶的基础知识,（一）酶是生物催化剂 酶是生物细胞产生的、具有催化能力的生物催化剂。 催化高效性 专一性：结构专一性；立体异构专一性 酶具有不稳定性 反应条件温和,6,（二）酶的化学本质,蛋白质,酶,单纯酶,结合酶,（全酶）= 酶蛋白 + 辅因子,辅因子,辅酶,与酶蛋白结合得比较松的小分子有机物。,辅基,与膜蛋白结合得紧密的小分子有机物。,金属激活剂,金属离子作为辅助因子。,7,必需基团：这些基团若经化学修饰使其改变，则酶的活性丧失。,活性部位：酶分

3、子中直接与底物结合，并和酶催化作用直接有关的部位。,必需基团,活性部位,维持酶的空间结构,结合基团,催化基团,专一性,催化性质,现代酶工程的主要内容,酶的分离纯化、大批量生产及新酶和酶的应用开发； 酶和细胞的固定化及酶反应器的研究，包括酶传感器、 反应检测； 酶生产中基因工程技术的应用及遗传修饰酶的研究； 酶的分子改造和化学修饰，结构与功能的研究； 有机相中酶反应的研究； 酶的抑制剂、激活剂的开发与应用研究； 抗体酶、核酸酶的研究； 模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成研究。,酶的来源,从生物体中提取分离 化学合成：固相合成多肽技术,早期酶的生产多以动植物为主要原料,植物提供的酶主要有： 蛋

4、白酶、淀粉酶、氧化酶等。 动物组织提供的酶主要有： 胰蛋白酶、脂肪酶和用于奶酪生产的凝乳酶等。 不适合大规模生产：动植物来源有限、生产周期长，以及地理、气候和季节影响。,目前工业生产一般都以微生物为主要来源,利用微生物生产酶制剂，具有如下优点： 微生物种类繁多，酶的品种齐全。 微生物生长繁殖快、生产周期短、产量高。 培养方法简单，原料来源丰富，价格低廉。 微生物具有较强的适应性和应变能力，可以通过各种遗传变异的手段，培育出新的高产菌株。 所以，目前工业上应用的酶大多采用微生物发酵法来生产。,酶的生产菌,作为一个优良的产酶菌种应具备以下几点要求： 繁殖快、产酶量高，酶的性质应符合使用要求，而且最

5、好是产生胞外酶的菌。 不是致病菌，在系统发育上与病原体无关，也不产生有毒物质。这一点对医药和食品用酶尤为重要。 产酶性能稳定，不易变异退化，不易感染噬菌体。 能利用廉价的原料，发酵周期短，易于培养。,生产菌的来源,从菌种保藏机构和有关研究部门获得。 大量的需要要从自然界中分离筛选。自然界是产酶菌种的主 要来源，土壤、深海、温泉、火山、森林等都是菌种采集地。 筛选产酶菌的方法：采集、菌种的分离初筛、纯化、复筛和生产性能检定等。 菌种改良的途径：应用遗传学原理进行基因突变、基因转移和基因克隆。,14,目前常用的产酶微生物,E.coli ：是应用最广泛的产酶菌。分泌胞内酶，经细胞破碎分离得到。在工业

6、上用于生产谷氨酸脱羧酶、天门冬氨酸酶、青霉素酰化酶、-半乳糖苷酶 枯草杆菌：主要用于生产-淀粉酶、-葡萄糖氧化酶、碱性磷酸脂酶。,15,啤酒酵母：用于酿造啤酒、酒精、饮料、面包等 曲酶（黑曲酶和黄曲酶）：主要生产糖化酶、蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、氨基酰化酶和脂肪酶。 其它产酶菌：青霉菌、木霉菌、根霉菌、链霉菌等,16,酶在医药领域的应用,1、在疾病诊断方面的应用 由于酶具有专一性强、催化效率高、作用条件温和等显著的催化特点，酶学诊断已经发展成为可靠、简便又快捷的诊断方法，具有广阔的应用前景。 酶学诊断方法包括两个方面，一是根据体内原有酶活力的变化来诊断某些疾病，二是利用酶来测定体内

7、某些物质的含量，从而诊断某些疾病。,17,（一）根据体内酶活力的变化诊断疾病 一般健康人体内所含有的某些酶的量是恒定在某一范围的。当人们患上某些疾病时，则由于组织、细胞受到损伤或者代谢异常而引起体内的某种或某些酶的活力发生相应的变化。故此，可以根据体内某些酶的活力变化情况，而诊断出某些疾病。,20,（二）用酶测定体液中某些物质的变化诊断疾病： 人体在出现某些疾病时，由于代谢异常或者某些组织器官受到损伤，就会引起体内某些物质的量或者存在部位发生变化。通过测定体液中某些物质的变化，可以快速、准确地对疾病进行诊断。酶具有专一性强、催化效率高等特点，可以利用酶来测定体液中某些物质的含量变化，从而诊断某

8、些疾病。,22,2、在疾病治疗方面的应用酶类制剂 酶可以作为药物治疗多种疾病，用于治疗疾病的酶称为药用酶。药用酶具有疗效显著，副作用小的特点，在疾病的治疗方面的应用越来越广泛,24,消化类：研究最早，是品种最多的一类酶. 在这一类酶中主要有胃蛋白酶、胰酶、淀粉酶、纤维素酶、木瓜酶、凝乳酶、无花果酶、菠萝酶等。,健美生消化酶帮助肠胃蠕动,25,抗炎净创类：目前在治疗上发展最快，用途最广的一种。 多数是蛋白质水解酶，分解发炎部位纤维蛋白的凝结物，消除伤口周围的坏疽、腐肉和碎屑。 其中有些酶能够分解脓液中的核蛋白使成简单的嘌呤和嘧啶，降低脓液的粘性、达到净洁创口、消除痴皮、排除脓液抗炎消肿的目的。

9、主要有胰蛋白酶、糜蛋白酶、双链酶，-淀粉酶、胰脱氧核糖核酸酶等。,26,血凝和解凝类：这类酶都是从血液中提取出来的。 凝血酶的作用是促使血中纤维蛋白元变成不溶性纤维蛋白,从而促使血液凝固，防止微血管出血。 纤维蛋白溶解酶的作用是溶解血块，为目前临床上最新的一种酶制品,治疗血栓静脉炎、冠状动脉栓塞等。 抑肽酶作为肽酶抑制剂，广泛应用于体外循环手术，大剂量抑肽酶可明显减少心脏外科手术后的渗血，消除因心脏外科手术后渗血而导致的死亡,27,解毒类：主要作用是解除体内或因注射某种药物产生的一种有害物质。 主要品种有青霉素酶、过氧化氢酶和组织胺酶等。 青霉素酶能够分解青霉素分子中的一内酰胺环，使变成青霉噻

10、唑酸，消除因注射青霉素引起的过敏反应。,28,3、在药物生产方面的应用 利用酶的催化作用将前体物质转变为药物。这方面的应用日益增多。现已有不少药物包括一些贵重药物都是由酶法生产的 4.在分析检测方面的应用 酶法检测或酶法分析 如：ELISA、免疫组织化学、Western blot中的HRP,第二节 酶的分离纯化,细胞破碎 酶的提取 酶的分离方法 酶的组合分离纯化策略 酶的浓缩、干燥与结晶,31,一、酶的分离纯化技术路线,细胞破碎,酶提取,酶分离纯化,酶浓缩,酶贮存,动物、植物或微生物细胞,发酵液,离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。,32,二、酶的提取,（一

11、） 细胞破碎 许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破碎处理。 1）机械破碎 2）物理破碎 3）化学破碎 4）酶解破碎,JY92-II D超声波 细胞粉碎机,细胞破碎珠,高压细胞破碎机,DY89-I型 电动玻璃匀浆机,33,采用缓冲体系：以防pH值大幅度变化而失活 添加保护剂：防活性基团活性中心受影响 抑制水解酶的作用 其它保护措施：温度，pH值，搅拌，光照，氧化等影响,34,（二）酶的抽提,35,(三）沉淀分离,36,三、酶的纯化,过滤与膜分离 电泳 离子交换层析,第三节 酶和细胞的固定化,38,酶应用过程中的一些不足,酶的稳定性较差：除了某些耐高温的酶，如-淀粉酶、Ta

12、q酶等；和胃蛋白酶等可以耐受较低的pH条件以外，大多数的酶在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活。 酶的一次性使用：酶一般都是在溶液中与底物反应，这样酶在反应系统中，与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力，也难于回收利用。这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产。 产物的分离纯化较困难：酶反应后成为杂质与产物混在一起，无疑给产物的进一步的分离纯化带来一定的困难。,固定化技术,固定化技术就是为了克服酶在工业应用中的不足，使酶催化反应能像化学催化剂一样在多相反应过程中稳定操作，并易于回收和反复使用而发展起来的一项酶化学与酶工程技术。,3

13、9,固定化酶简介,1916年，Nelson和Griffin最先发现了酶的固定化现象。 固定化酶的研究从20世纪50年代开始，1953年德国的Grubhofer和Schleith采用聚氨基苯乙烯树脂为载体，经重氮化法活化后，分别与羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核酸核糖酶等结合，制成固定化酶。 20世纪60年代后期，固定化技术迅速发展。1969 年，日本千佃一郎首次应用固定化氨基酰化酶从混合氨基酸中大规模生产L-氨基酸，实现了酶应用史上的一大变革，开辟了固定化酶工业化应用的新纪元。这时人们已经预感到了固定化酶以后可以在现代酶工程以及整个生物工程中占有的重要作用, 它在应用上和理论上的巨大潜力吸引了生物

14、化学、微生物学、医学、化学工程和高分子等领域的科研机构及企业科技部门研究人员的注意力。,40,从1970年代初开始酶的固定化技术研究发展很快，促使酶工程作为一个独立学科从发酵工程中脱颖而出，才真正登上历史舞台。至1980年代初，每年约发表1000篇以上的文献和近200篇专利，所报道的固定化方法达100种以上。 1980年代中以后，酶和细胞固定化研究的发展速度开始减慢，从而有人认为，对酶的固定化技术应予以重新评价，理由是尽管已经做了大量研究工作，但工业中实际应用的案例尚少，经过近20年的研究，真正能获得规模应用的固定化酶，还仅局限于葡萄糖异构酶、葡萄糖氧化酶和青霉素酰化酶等为数不多的几个酶种。,

15、41,我国的固定化酶研究开始于1970 年, 首先是微生物所和上海生化所的酶学工作者同时开始了固定化酶的研究工作。 对于固定化酶，曾经有过固相酶、水不溶酶、固定酶等多种名称。在1971年召开的第一次国际酶工程学术会议上，确定固定化酶的统一英文名称为immobilized enzyme。,（一）固定化酶的制备,1、固定化酶（immobilized enzyme）的定义：指限制或固定于特定空间位置的酶。具体讲是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。制备固定化酶的过程称为酶的固定化。 固定化所采用的酶，可以是纯化的酶，也可以是结合在菌体（死细胞）或细

16、胞碎片上的酶或酶系。,2、固定化酶的特点,可以多次使用，酶的稳定性提高； 反应后，酶与底物和产物易于分开，产物中无残留酶，易于纯化。 反应条件易于控制，可实现转化反应的连续化和自动控制； 酶的利用率高，单位酶催化的底物量增加，用酶量少； 比水溶性酶更适合于多酶反应。,固定化酶缺点,固定化时，酶活力有损失 增加了生产成本、初始投资大 只能用于可溶性底物，而且较适于小分子底物，不适宜大分子底物 胞内酶必须经过酶的分离纯化 于完整菌体相比不适宜多酶反应，特别是需要辅助因子的反应,3、酶和细胞固定化方法,酶的固定化（enzyme immobilization）是指采用有机或无机固体材料作为载体，将酶包

17、埋起来或束缚、限制于载体的表面和微孔中，使其仍具有催化活性，并可回收及重复使用的酶化学方法与技术。 不使用固体材料作为载体，通过酶分子之间的相互交联形成聚集体，也可将酶固定化，称为无载体酶固定化1990年代初报道的交联酶晶体（crosslinked enzyme crystals，CLEC）就属于无载体固定化酶 。,酶和细胞的固定化方法,酶和细胞固定化模式,（1）载体结合法,将酶结合于不溶性载体上的固定化方法。 A、物理吸附法：用物理方法将酶吸附于不溶性载体上的固定化方法。载体如：活性碳、多孔玻璃、树脂等。 优点：操作简单，可选用不同电荷和不同形状的载体，有可能固定化和纯化过程同时实现，酶失活

18、后载体仍可再生。 缺点：最适吸附酶量无规律可循，吸附量与酶活力不一定呈平行关系，酶与载体结合力不强，酶易于脱落，导致酶活下降并污染产物，故不常用。,49,B、离子结合法：酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性载体上。如：DEAE-纤维素。 优点：操作简单，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏。 缺点：载体和酶的结合力弱，易受缓冲液种类或pH的影响，离子强度高时，酶易脱落。,离子交换剂结合蛋白能力较强，故常用,50,C、共价结合法：酶以共价键结合于载体上。即将酶分子上非活性部位功能团与载体表面反应基团进行共价结合的方法。 优点：酶与载体结合牢固，稳定性好，不易脱落。(目

19、前研究最为活跃的一类酶固定化方法 ) 缺点：载体要活化，反应条件苛刻，操作复杂，反应条件剧烈，酶易失活和产生空间位阻效应,常常会引起酶蛋白高级结构发生变化，并导致活性中心受到破坏,难以得到比活高的固定化酶，甚至底物的专一性等性质也可能发生变化。,载体结合法 注意事项,首先要注意载体活化，使载体获得能与酶分子的某一特定基团发生特异反应的活泼基团。活化方法有酰基化、芳基化、烷基化和氨甲酰化反应等。 酶蛋白上参与共价结合的氨基酸残基不应该是酶催化活性所必需的，避免固定化后酶活力丧失。 反应条件尽可能温和。,（2）交联法,采用双功能团试剂或多功能团试剂进行酶分子之间的交联，使酶分子和双功能团试剂或多功

20、能团试剂之间形成共价键，得到三维的交联网状结构 常用的交联剂：戊二醛、双重氮联苯胺-2、2-二磺酸、1,5-二氟-2,4-二硝基苯。,53,酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价结合 酶分子；（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶,交联法又分：交联酶法、酶与辅助蛋白交联法、吸附交联法和载体交联法。 交联法反应条件剧烈，固定化酶的酶活回收率低（故尽可能降低交联剂浓度和缩短反应时间），会引起酶活性中心结构的改变，导致酶活性降低（常加入辅助蛋白如牛血清蛋白提高固定化酶的稳定性），因此常与吸附法或包埋法联合使用。

21、,（3）包埋法,包理法是将酶包裹于凝胶形成的网络结构中，或半透膜聚合物的超滤膜内使其固定化。适用于多种酶、粗酶制剂、细胞器和细胞的固定化。 包埋法一般不需要与酶蛋白的氨基酸残基进行结合反应，很少改变酶的空间构象，酶活回收率较高，因此可以应用于许多酶的固定化。但是包埋法制备的固定化酶，只适合用于小分子底物和产物的酶催化反应，因为只有小分子反应底物或产物，才可以通过高分子凝胶的网格进行扩散。由这种固定化方法产生的扩散阻力，还会使固定化酶的动力学行为发生改变，从而降低酶活力。 包埋法可分为网络型和微囊型两种。前者是将酶包埋于高分子凝胶细微网络内；而后者是将酶包埋在高分子半透膜中制备成微囊型。,56,

22、A、网格型：将酶或细胞包埋在高分子凝胶细微网格中。 常用合成高分子化合物有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光敏树脂。天然高分子化合物有淀粉、明胶、胶原、海藻胶、角叉菜胶。多用于固定化细胞,57,B、微囊型：将酶或细胞包埋在高分子半透膜中。通常为直径几微米到几百微米的球状体。颗粒比网格型要小得多，比较有利于底物与产物的扩散，但反应条件要求高，制备成本也高。,海藻酸钠与CaCO3（“蛋盒”模型，形成热不可逆凝胶）； 壳聚糖（阳离子胺基）与海藻酸钠，通过正负电荷吸引，产生瞬时凝胶化作用，形成聚电解质半透膜； 壳聚糖胺基与戊二醛基形成shiff氏碱，在胶囊表面形成一层致密的保护膜，可增加微胶囊球的强度，能有效的

23、防止磷脂酶从微胶囊中泄漏，而提高固定化酶的活力回收。,不同磷脂酶作用于磷脂部位示意图,（4） 选择性热变性法,专用于细胞固定化，是将细胞在适当温度下处理使细胞膜蛋白变性但不使酶变性而使酶固定于细胞内的方法。,4、酶和细胞的固定化载体,载体条件： 固定化过程中不引起酶变性 对酸碱有一定的耐受性 有一定的机械强度 有一定的亲水性和良好的稳定性 有一定的疏松网状结构，颗粒均匀 共价结合时具有可活化基团 有耐受酶和微生物细胞的能力 价廉易得、经济环保 固定化载体主要有三类：吸附载体、包埋载体和共价结合载体,5、新型的酶固定化方法,温和的条件下进行，减少酶活力损失，提高固定化效率 光偶联法：光敏性单体聚

24、合物包埋固定化酶或带光敏性基团的载体共价固定化酶 等离子体法：高度激发的原子、分子，自由基的聚集体，载体表面用等离子体修饰，引入活性基团,无载体固定化酶直接用交联剂交联 用交联剂交联溶解酶、晶体酶、物理聚集酶、和喷雾干燥酶等四种无载体酶体系，优点如下： 催化活性高，成本低 具备较高的催化剂比表面 可加入多种酶 底物扩散受限制少 极端条件下稳定性高,（二）固定化细胞,通过各种方法将细胞与水不溶性的载体结合，制备固定化细胞的过程称为细胞固定化。 固定化细胞是指固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞。固定化细胞能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢，故也称为固定化活细胞、固定化增值细胞、第二代

25、固定化酶。 微生物细胞、植物细胞和动物细胞都可以制成固定化细胞。固定化细胞可以提高生产效率，延长生产周期，并易于细胞的分离和回收。目前，固定化细胞技术已应用于食品工业、发酵工业和三废处理工业，经济效益显著。,65,固定化细胞简介,固定化酶和固定化菌体的应用进一步推动了固定化技术的发展。20世纪70年代后期出现固定化细胞技术。由于固定化细胞技术不需要把酶从细胞中提取出来，酶活力损失少，酶活回收率较高,因此该技术的应用已经超过固定化酶的应用。细胞被固定化后细胞密度高、反应速度快、耐毒害能力强、产物分离容易、能实现连续操作，可以大大提高生产能力等优势，因此在近几十年来固定化细胞技术得到了迅速的发展和

26、广泛的应用。通常只能用于胞外酶等胞外产物的生产。 1959 年Hattori首次将大肠杆菌E. coli 吸附在树脂上实现细胞固定化，随后固定活细胞或称为固定化增殖细胞的研究工作相继展开。 1973年, 含有L- 天冬氨酸酶的微生物被固定化, 并用于L- 天冬氨酸的生产。,66,1976年，法国首次用固定化酵母细胞生产啤酒和酒精。 1978年，日本固定化枯草杆菌细胞生产-淀粉酶； 1984年，中国开始进行固定化细胞生产-淀粉酶、糖化酶和果胶酶等的研究。 20世纪70年代中期以来，动植物细胞培养技术迅速发展。动物细胞主要用于生产疫苗、抗体、多肽药物、酶等功能蛋白质，其中大多数动物细胞具有贴壁生长

27、的特性，采用固定化动物细胞培养技术，更加具有重要意义。植物细胞也可以采用固定化植物细胞培养。动植物细胞固定化的研究和应用进一步扩展了固定化技术的研究、开发。 近年来还开展了固定化动植物细胞生产次级代谢产物的研究工作。,67,固定化细胞的优点,无需进行酶的分离纯化，节约酶的分离过程及费用; 属于多酶系统，可催化一系列反应，无需辅酶再生; 细胞生长停滞时间短，抗污染能力强; 固定化细胞可以重复或长期使用，简化游离细胞培养过程，还减少了营养基质的浪费; 保持酶的原始状态，提高酶的稳定性; 使用固定化细胞反应塔连续发酵，可以避免反馈抑制和产物的消耗。,68,固定化细胞的缺点,部分载体材料有时会对细胞产

28、生生理毒性，将导致细胞死亡，菌体自溶，影响产物的纯度或影响目标代谢产物的生物合成; 细胞膜或细胞壁会造成底物渗透和扩散的障碍; 有些载体材料使细胞或小细胞群体相互分隔，容易形成不利于细胞之间彼此协调的环境，影响代谢产物的生物合成; 大规模制备固定化细胞过程复杂，易引起杂菌污染; 细胞内有多种酶存在，会形成副产物; 载体材料使成本提高，以至于该技术在传统的发酵工业中难以推广。,固定化细胞的制备技术,细胞固定化主要适用于胞内酶，要求底物和产物透过细胞膜，细胞内不存在产物分解系统及其他副反应。 载体结合法、包埋法、交联法、无载体法,（1）载体结合法制备技术,将细胞悬浮液直接与水不溶性载体相结合。载体

29、主要为阴离子交换树脂、阴离子交换纤维素、聚氯乙烯。 优点：操作简单，符合细胞的生理条件，不影响细胞的生长及酶活性。 缺点：吸附容量小、结合强度低。,（2）包埋法制备技术,与包埋酶法相同，将细胞定位于凝胶网格内。是固定化细胞中应用最多的方法。 常用载体有卡拉胶、聚乙烯醇、琼脂等。 优点：细胞容量大，操作简便，酶的活力回收率高 缺点：扩散阻力大，容易改变酶的动力学行为，不适于催化大分子底物与产物的转化反应。,（3）交联法制备技术：由于所用交联剂戊二醛等对细胞有毒性，一般很少用。 （4）无载体法制备技术：靠细胞自身的絮凝作用制备固定化细胞的技术。通过助凝剂或选择性热变性的方法实现细胞的固定化。可以获

30、得高密度细胞，固定化条件温和，但是机械强度差。 此外还有粘合法，截留法等,73,（三）固定化方法与载体的选择依据,酶可以通过各种不同的方法进行固定化，但不管是通过物理的弱相互作用，还是通过较强的化学键结合，都必须采用不溶于水的材料作为固定化载体。 任何一种固定化方法或固定化载体，都不可能适用于所有的酶，要想获得较好的固定化效果，必须根据具体的酶和催化反应类型，选择合适的固定化方法和载体。 和多相化学催化剂的制备一样，要想通过选择固定化方法和载体，制备出性能最佳的固定化酶，没有现成的规律可循，往往依赖于实际工作经验的积累，最后以是否能最大限度地保留酶活性和提高酶的稳定性为评价标准。,固定化方法的

31、选择依据,（1）固定化酶应用的安全性：要按照药物和食品领域的检验标准作必要的检查。所用试剂是否有毒性和残留。尽可能选择无毒性试剂。 （2）固定化酶在操作中的稳定性：在选择固定化方法时要求固定化酶在操作过程中十分稳定，能长期反复使用，在经济上有极强的竞争力。 （3）固定化的成本：包括酶、载体、试剂的费用，也包括水、电、气、设 备和劳务投资等。注意综合考虑。,（四）固定化酶（细胞）的性质与指标,1、固定化酶的形状 不同材料可以制成相同形状固定化酶，如卡拉胶、琼脂等均可制成酶片或酶块；同种材料也可以制成不同形状的固定化酶，如海藻胶可以制成酶片或酶块或酶珠。 同种方法可以制成不同形状，如包埋法可以制造

32、酶珠、酶胶囊；而不同方法也可以制成相同形状，如交联法、吸附法和共价法均可制造酶粉。 因此，固定化酶形状是由底物和产物的性质、基质材料的性能、固定化方法、酶反应性质、反应器类型或应用目的决定的。,（1）颗粒状：包括酶珠、酶块、酶片、酶粉。每种固定化方法均可制备颗粒状，方法简单，比表面积大，转化效率高，适用各种反应器。如酵母酶珠。 （2）纤维状：三醋酸纤维素用适当的溶剂溶解后与酶混合，再用喷丝的方法就可制成酶纤维。比表面积大，转化效率高，但只适用于填充床反应器。此外，纤维酶可以织成酶布用于填充床反应器。,（3）膜状固定化酶：可通过共价结合的方法将酶偶联在滤膜上。也可用交联等其他方法制膜酶。酶膜比表

33、面积大，渗透阻力小，可用于酶电极，破碎后也可用于填充床。目前已有木瓜酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、脲酶等酶膜。 （4）管状固定化酶：又称酶管，利用管状载体如尼龙、聚氯苯乙烯和聚丙烯酰胺，经活化后与酶偶联得酶管。酶管的机械强度大，切短后可用于填充床反应器，也可组装成列管式反应器。目前已制备出糖化酶、转化酶、脲酶等酶管。,2、固定化酶的性质 酶经过固定化后，其催化反应体系由均相转变为非均相。由于固定化方法和所用载体的不同，固定化酶受到扩散限制、空间障碍、微环境变化和化学修饰等因素的影响，从而导致酶学性质和酶活力的变化。,（1）酶活力的变化：酶经过固定化之后活力大都下降。 原因主要：酶活性中心的重要

34、氨基酸与载体发生结合，酶的空间结构发生变化；酶与底物结合时存在空间位阻效应，影响活性中心对底物的定位；包埋法中酶被高分子物质包围，大分子物质不能透过膜，导致底物与产物扩散阻力增大。 解决办法：反应条件尽可能温和；加入抑制剂、底物或产物保护酶活性中心。 但是，由于偶联过程中酶得到化学修饰，或固定化过程中提高了酶的稳定性，某些酶在固定化后酶活力得到提高。,（2）酶稳定性的变化：稳定性包括对温度、pH、蛋白酶变性剂和抑制剂的耐受程度。 固定化后，稳定性提高，有效寿命延长。其原因是限制了酶分子之间的相互作用，阻止其自溶，增加酶构型的牢固程度。 但是，当固定化过程影响到酶活性中心和酶的高级结构的敏感区域

35、，也将导致酶活性降低。,a、热稳定性提高：热稳定性越高，工业化意义越大。热稳定性高可以提高反应温度和反应速度，提高效率。 b、操作稳定性：实际应用的关键所在，通常用半衰期表示。半衰期达到1个月以上时，即具有工业应用价值。 c、贮藏稳定性：一般不能长期贮存，现做现用，否则活力逐渐下降。若需长期保存，可在贮存液中添加底物、产物、抑制剂和防腐剂，并于低温保存。 d、对蛋白酶的稳定性：大多数天然酶经固定化后对蛋白酶的耐受力有所提高，有利于工业化生产。可能的原因是由于空间位阻效应使蛋白酶不能进入固定化酶内部。,（3）酶学特性的变化 A、底物专一性：由于位阻效应，对底物的专一性明显下降。 B、最适pH：最

36、适pH可能变大，也可能变小；pH-酶活曲线可能发生变化，其变化与酶蛋白和载体的带电性质有关。 带负电荷的载体使pH偏大；带正电荷的载体使之偏小；中性载体通常不改变最适pH。 pH-酶活曲线与游离酶相比，或保持相同的钟罩型、或变得更陡、或更平坦。,C、最适温度：一般升高。原因是固定化后空间结构更为稳定。有些酶不变或下降，如多空玻璃共价结合的葡萄糖异构酶和亮氨酸氨肽酶的最适温度与游离酶一样。 D、米氏常数（Km） ：Km值均发生变化，有的增加很小，有的增加很大，但不会变小。当底物为大分子时，采用包埋法固定则Km增加较大；底物为小分子时， Km变化不大。 E、最大反应速度（Vm）：变化很小或不变。,

37、3、固定化细胞的性质,细胞的固定化，需要采用适当措施提高细胞膜的通透性来提高胞内酶的活力和转化效率。固定化细胞与固定化酶的性质基本相似。 最适pH变化无特定规律 最适温度一般与游离细胞相同，但个别也会提高。 稳定性一般会提高，因此决定其工业的广泛应用。,（五）评价固定化酶（细胞）的指标,1、固定化酶活力测定 单位时间内，单位体积中的底物减少量或产物增加量表示。 对底物或产物具有光吸收、旋光、电位差或荧光性质的变化，可以直接测定。 对不能通过底物或产物的变化量来测定其活力的反应，可通过与其产物相偶联的酶促反应来测定活力。,根据固定化酶的反应系统，活力测定可分为分批测定和连续测定。 分批测定：固定

38、化酶在搅拌或震荡情况下进行，间隔一定时间取样，过滤后按常规方法测定。测定结果与反应器形状、大小、反应液数量、搅拌和震荡速度有关。速度加快，活力增加，但增加到一定活力后会恒定；搅拌过快会导致固定化酶破碎，因此要严格控制反应条件。 连续测定：引出反应液到流动比色杯中进行分光测定；或在连续流反应器中，根据底物的流入速度和反应速度之间的关系计算酶活力，此时注意反应器形状对反应速度的影响。,影响酶活力测定的因素很多，如测定环境、pH、温度、离子强度、酶浓度、震荡和搅拌速度以及固定化酶颗粒大小变化等，为确保可比性，必须严格控制反应条件的一致性。 实际应用中，测定条件应尽可能与实际工艺条件相同。,2、偶联率

39、及相对活力的测定 活力回收率=固定化酶总活力/加入酶的总活力 相对活力固定化酶总活力/（加入酶的总活力上清液中未偶联的酶活力） 偶联率（加入酶活力上清液酶活力）/加入蛋白活力 偶联率=1，表示反应控制好，固定化或扩散限制引起的酶失活不明显；1时，有细胞分裂或从载体排除抑制剂等因素影响。,3、半衰期，即酶的活力降为初活力一半时所经历的连续操作时间，用T1/2表示。 4、热稳定性：将固定化酶在不同温度下温育1 h，在最适温度下测酶活力，一般保持在60%以上。,（七）酶传感器,（一）原理 它将活性物质酶覆盖在电极表面，酶与被测的有机物或无机物反应，形成一种能被电极响应的物质。 1967年Updick

40、和Hicks将固定化的葡萄糖氧化酶膜结合在氧电极上，做成了第一支葡萄糖电极；此后，这类酶传感器通常是通过检测产物H2O2的浓度变化或氧的消耗量来检测底物。,用葡萄糖氧化酶电极测定血液、尿、发酵液中的葡萄糖浓度； 用脲酶电极测定血液中的尿素浓度,酶传感器主要类型,酶催化特定底物发生反应，从而使特定生成物的量有所增减.用能把这类物质的量的改变转换为电信号的装置和固定化酶耦合，即组成酶传感器. 依据信号转换器的类型,酶传感器大致可分为酶电极(主要包括离子选择电极、气敏电极、氧化还原电极等电化学电极)、酶场效应晶体管传感器(FET-酶)和酶热敏电阻传感器等。,离子敏场效应晶体管酶传感器（ISFET）

41、对离子或分子敏感的半导体器件 ISFET与常用的绝缘栅型场效应晶体管构造相同不过在输入栅极做了一些改进，以能与特定的化学物质反应，产生电位的酶膜取代金属极让酶膜直接与溶液接触，由于酶膜对溶液中的离子有选择作用，从而调制ISFET的漏电流变化，利用这个特性就能检测一溶液中的离子活度,第四节 固定化酶和固定化细胞的反应器,固定化酶和固定化细胞能否用于工业化生产，关键取决于酶反应器的设计和选择,1、什么是酶反应器,2、酶反应器类型及特点,3、酶反应器的选择,Go,Go,Go,99,1、什么是酶反应器,迄今，人们已发明了把酶固定化的多种技术。可以使酶与之结合的固体材料，常用的有纤维素、葡聚糖、琼脂糖、

42、高分子聚合物及多孔无机材料等等。人们把这些材料制成含有大量空隙的形态，使其具有较大的表面积。 在一定的条件下，酶可以与这些材料以物理吸附、化学键形成或生物特异性结合等方式结合，有时也可以是固体材料网络把酶包起来。将这些结合了酶的载体材料装填成柱或别的形式的反应装置，再配以进出料及其他条件的控制设备，便成了一种新型的反应器-固定化酶生物反应器。,100,用于酶进行催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器。,酶反应器是根据酶的催化特性而设计的反应设备。其设计的目标就是生产效率高、成本低、耗能少、污染少，以获得最好的经济效益和社会效益。,酶反应器是用于完成酶促反应的核心装置。它为酶催化反应提供合适的场

43、所和最佳的反应条件，以便在酶的催化下，使底物（原料）最大限度地转化成产物。它处于酶催化应过程的中心地位，是连接原料和产物的桥梁。,101,酶催化反应过程示意图,102,理想的酶反应器要求,生物反应器设计的主要目标： 使产品的质量最高，生产成本最低。 评价生物反应器的主要标准： 反应器生产能力的大小和产品质量的高低。,(4) 应具有最佳的无菌条件，否则，杂菌污染使反应器的生产能力下降。,(1) 所用生物催化剂应具有较高的比活和酶浓度（或细胞浓度），才能得到较大的产品转化率。,(2) 能用电脑自动检测和调控，从而获得最佳的反应条件。,(3) 应具有良好的传质和混合性能。传质是指底物和产物在反应介质

44、中的传递。传质阻力是反应器速度限制的主要因素。,103,2、酶反应器类型及特点,酶反应器的种类有常用于饮料和食品加工工业的搅拌罐型反应器，使用最广泛的固定化酶反应器的固定床型反应器，适合于生化反应的膜式反应器等。,104,常见的酶反应器类型,按结构区分 搅拌罐式反应器（Stirred Tank Reactor, STR） 鼓泡式反应器(bubble column reactor, BCR ) 填充床式反应器(packed column reactor, PCR ) 流化床式反应器( Fluidized Bed Reactor, FBR) 膜反应器(Membrane Reactor, MR) 按

45、操作方式区分 分批式反应(batch ) 连续式反应(continuous ) 流加分批式反应(feeding batch ) 按二者混合形式区分 连续搅拌罐反应器（Continuous Stirred Tank Reactor, CSTR） 分批搅拌罐反应器（Batch Stirred Tank Reactor, BSTR）,105,(1)间歇式酶反应器,又称为批量反应器（Batch Reactor BSTR）、间歇式搅拌罐、搅拌式反应罐。其特点是：底物与酶一次性投入反应器内，产物一次性取出；反应完成之后，固定化酶（细胞）用过滤法或超滤法回收，再转入下一批反应。 优点是：装置较简单，造价较低

46、，传质阻力很小，反应能很迅速达到稳态。 缺点是：操作麻烦，固定化酶经反复回收使用时，易失去活性，故在工业生产中，间歇式酶反应器很少用于固定化酶，但常用于游离酶。,106,(2)连续式酶反应器,又称为连续搅拌釜式反应器（Continuous Stirred Tank Reactor, CSTR）、连续式搅拌罐。向反应器投入固定化酶和底物溶液，不断搅拌，反应达到平衡之后，再以恒定的流速连续流入底物溶液，同时，以相同流速输出反应液（含产物）。 与BSTR的区别：连续进料、连续出料。 优点是：在理想状况下，混合良好，各部分组成相同，并与输出成分一致。 缺点是：搅拌浆剪切力大，易打碎磨损固定化酶颗粒。,

47、底物溶液进口,反应液出口,107,(3)填充床反应器,填充床反应器（Packed Reactor,PBR）,又称固定床反应器。将固定化酶填充于反应器内，制成稳定的柱床，然后，通入底物溶液，在一定的反应条件下实现酶催化反应，以一定的流速，收集输出的转化液（含产物）。 优点是：高效率、易操作、结构简单等，因而，PBR是目前工业生产及研究中应用最为普遍的反应器。它适用于各种形状的固定化酶和不含固体颗粒、黏度不大的底物溶液，以及有产物抑制的转化反应。 缺点是：传质系数和传热系数相对较低。当底物溶度含固体颗粒或黏度很大时，不宜采用PBR。,108,(4)流化床反应器,流化床反应器（Fluidized B

48、ed Reactor, FBR）。 特点是：底物溶液以足够大的流速，从反应器底部向上通过固定化酶柱床时，便能使固定化酶颗粒始终处于流化状态。其流动方式使反应液的混合程度介于CSTR的全混型和PBR的平推流型之间。 FBR可用于处理黏度较大和含有固体颗粒的底物溶度，同时，亦可用于需要供气体或排放气体的酶反应（即固、液、气三相反应）。 因FBR混合均匀，故不适用于有产物抑制的酶反应。,109,(5)鼓泡式反应器,鼓泡式反应器(bubble column reactor, BCR)是利用从反应器底部通入的气体产生的大量气泡，在上升过程中起到提供反应底物和混合两种作用的一类反应器。也是一种无搅拌装置的

49、反应器。 鼓泡式反应器可以用于游离酶和固定化酶的催化反应。在使用鼓泡式反应器进行固定化酶的催化反应时，反应系统中存在固、液、气三相，又称为三相流化床式反应器。 鼓泡式反应器的结构简单，操作容易, 剪切力小，物质与热量的传递效率高，是有气体参与的酶催化反应中常用的一种反应器。例如氧化酶催化反应需要供给氧气，羧化酶的催化反应需要供给二氧化碳等。,110,(6)膜反应器,膜反应器（membrane reactor, MR）是将酶催化反应与半透膜的分离作用组合在一起而成的反应器。可以用于游离酶的催化反应，也可以用于固定化酶的催化反应。 用于固定化酶催化反应的膜反应器是将酶固定在具有一定孔径的多孔薄膜中

50、，而制成的一种生物反应器。 膜反应器可以制成平板型、螺旋型、管型、中空纤维型、转盘型等多种形状。常用的是中空纤维反应器。,111,简称CSTR-UFR。在CSTR（连续式搅拌罐）出口处设置一个超滤器。可以将小分子产物与大分子酶和底物分开，有利于产物回收。该反应器适用于颗粒较细的固定化酶、游离酶和细胞以及小分子产物与大分子底物。,游离酶在膜反应器中进行催化反应时，底物溶液连续地进入反应器，酶在反应容器的溶液中与底物反应，反应后，酶与反应产物一起，进入膜分离器进行分离，小分子的产物透过超滤膜而排出，大分子的酶分子被截留，可以再循环使用。,连续搅拌罐超滤膜反应器,112,(7)喷射式反应器,喷射式反

51、应器是利用高压蒸汽的喷射作用，实现酶与底物的混合，进行高温短时催化反应的一种反应器。 结构简单、体积小、混合均匀，催化速度快、效率高。只适用于耐高温游离酶的反应，已在高温淀粉酶的淀粉液化反应中广泛使用。,喷射罐和维持罐,113,(8)循环反应器,循环反应器(recycle reactor, RCR)是让部分反应液流出，与新加入的底物流入液混合，再进入反应床进行循环。 特点：可以提高液体的流速和减少底物向固定化酶表面传递的阻力，达到较高的转化率。 当底物为不溶性物质时，可以采用RCR。,114,各种酶反应器的特点,115,116,3 酶反应器的选择,从酶的应用形式、酶的反应动力学性质、底物和产物

52、的理化性质、操作要求及费用成本等方面来综合考虑选择酶反应器。 选择的酶反应器应尽可能结构简单、操作简便、易于维护和清洁、可适用多种酶的催化反应、制造成本和运行成本较低等。,（1）固定化酶的形状,溶液酶,回收困难,只适用于BSTR 颗粒及片状的固定化酶对CSTR和PBR均适用 膜及纤维片状的酶只适用PBR 固定化酶易变形,易粘及结颗粒时,采用FBR,（2）底物的物理性质 溶解性和浊液性底物，适合任何反应器；颗粒和胶状底物需要高速搅拌（减少底物颗粒的集结、沉淀和堵塞，但过高搅拌速度会使固定化酶从载体上被剪切下来）的CSTR、FBR和PCR。反应底物为气体时，通常选择鼓泡式反应器。 （3）反应的动力

53、学特性 PFR适合产物对酶活性具有抑制作用的反应；和CSTR相比， PFR总效率优于CSTR，特别是产物对反应有抑制作用时， PFR的优势更突出；底物对酶的活性有抑制作用时，CSTR比PFR有优势。酶反应器的催化反应速度一般是CSTR型随搅拌速度、PFR型随流速增加而加快。,（4）酶的稳定性 反应器的高速搅拌会使固定化酶脱落,或由于磨损，引起粒度减少而影响固定化酶的操作稳定性，以CSRT最为严重。选择反应器时，注意避免剪切力，减少外界环境对酶稳定性的影响.,（5）操作要求及成本费用,CSTR中可连续进行pH调整、补充反应物或酶，别的反应器则比较困难；（CSTR最便宜，有良好操作性，适应性强）

54、BSTR可用于溶液酶的催化反应，操作较CSTR方便； PFR有很高的转化率，尤其是有产物抑制酶反应时，明显优于BSTR和CSTR,但PFR容易产生高压降和压密现象，不适用于不溶性或黏性底物； FBR可用于不溶性或黏性底物的转化，低压降，但消耗动力大，不易直接模仿放大。 CSTR/UFR既适用于水溶性酶，也适用于不溶性或黏性底物，但长时间运转会使酶的稳定性降低，也容易被超滤膜吸附，并产生浓差极化现象。 PCR转化率高，可采用高速液流克服外扩散的限制，但设备成本高。,酶反应器应用的注意事项,（1）保持酶反应器的操作稳定性：一定时间后，检查酶活力，进行补充和替换 （2）保持流体的流动方式和状态：流动

55、状态的改变，会影响酶与底物，产物的接触 （3）防止酶的变性失活:控制温度，PH，金属离子，剪切力 （4）防止微生物污染：一般不必严格无菌操作，但底物与产物为营养物时，需防微生物污染。 一般要符合必要的卫生条件，生产药用或食品酶时，卫生条件要求较高。 措施： 要求环境清洁；反应器使用前后进行清洗和消毒；严格管理，经常检测；加消毒剂等；采用较高温度和低的PH,生产能力的下降及对策,酶反应器操作中，生产能力逐渐降低，主要原因是固定化酶活性降低或损失。造成固定化酶活性损失的原因： （1）酶本身的失活； （2）酶从载体上脱落； （3）载体的破碎或溶解。,固定化酶产品介绍,(1)氨基酰化酶：这是世界上第一

56、种工业化生产的固定化酶，可以用于生产各种L-氨基酸药物。 1969年，日本田边制药公司将从米曲霉中提取分离得到的氨基酰化酶，用DEAE-葡聚糖凝胶为载体通过离子键结合法制成固定化酶，将L-乙酰氨基酸水解生成L-氨基酸，用来拆分DL-乙酰氨基酸，连续生产L-氨基酸。剩余的D-乙酰氨基酸经过消旋化，生成DL-乙酰氨基酸再进行拆分。生产成本仅为用游离酶生产成本的60左右。,124,固定化酶法生产L-氨基酸,Aminoacylase 氨基酰化酶,125,储 罐,反应产物,消旋反应器,固定化酶柱子 DEAE-葡聚糖 氨基酰化酶,晶体 L-Ala,L-Ala A-D-Ala,A-L-Ala A-D-Ala

57、,126,(2)天门冬氨酸酶：1973年日本用聚丙烯酰胺凝胶为载体，将具有高活力天门冬氨酸酶的大肠杆菌菌体包埋制成固定化天门冬氨酸酶，用于工业化生产，将延胡索酸转化生产L-天门冬氨酸。 1978年以后，改用角叉菜胶为载体制备固定化酶，也可将天门冬氨酸酶从大肠杆菌细胞中提取分离出来，再用离子键结合法制成固定化酶，用于工业化生产。,127,(3)天门冬氨酸脱羧酶：将含天门冬氨酸脱羧酶的假单胞菌菌体，用凝胶包埋法制成固定化天门冬氨酸脱羧酶，于1982年用于工业化生产，催化L-天门冬氨酸脱去羧基，生产L-丙氨酸。,128,(4)青霉素酰化酶：是在药物生产中广泛应用的一种固定化酶。可用多种方法固定化。1

58、973年已用于工业化生产，用于制造各种半合成青霉素和头孢菌素。 用同一种固定化青霉素酰化酶，只要改变pH等条件，就既可以催化青霉素或头孢菌素水解生成6一氨基青霉烷酸(6一APA)或7一氨基头孢霉烷酸(7一ACA)，也可以催化6一APA或7一ACA与其他的羧酸衍生物进行反应，以合成新的具有不同侧链基团的青霉素或头孢霉素。,129,固定化细胞法生产6-氨基青霉烷酸,青霉素酰化酶与抗生素改造,130,131,132,E.Coli 斜面 细胞 固定化细胞 青霉素G 转化液 滤液 6-APA 粗品,培养,固定,转化,过滤,抽提,技术路线,133,青霉素酰化酶转化流程图,第五节 酶的人工模拟,模拟生物体系

59、是开辟新技术的途径之一，自觉地把生物界作为各种技术思想、设计原理和发明创造的源泉，通过对生物体系的结构与功能研究，为设计和建造新技术提供新思想、新原理、新方法和新途径，这已成为科学界的一种科学理念。因此，人们试图继承酶的优点，改变其易变性失活的缺点，并且希望能用有机合成的方法大量的制备酶，从而开始进行酶功能的模拟研究。 人工模拟酶（ artificial enzyme ）是为了顺应克服传统酶对热敏感、稳定性差、来源有限以及催化条件局限性等缺点的需要，而研制和开发的一种新型催化剂。人工模拟酶是近年来发展起来的仿生化学的重要方向， 同时利用这一系列新型催化剂也有利于促进化学工业向环保、绿色、无公害的理想境地发展。,1、模拟酶概念,所谓人工模拟酶就是指根据酶的作用原理，用各种方法人为制造的具有酶性质的催化剂，简称人工酶或模拟酶。它们一般具有高效和高适应性的特点，在结构上比天然酶相对简单。 固氮酶是人工模拟酶研究工作中研究最多的一种酶。其次是过氧化氢酶、糜蛋白酶等。如果模拟酶研究成功，能够人工合成高效率的酶型催化剂，不仅将从根本上改