细胞工程：第11章 植物组织培养

第11章植物组织培养

提要植物组织培养的理论基础植物组织培养实验材料的清洗与消毒培养基接种种质保存植物细胞的大规模培养技术

植物组织培养的理论基础植物的无性繁殖：不经过雌雄配子的结合，通过母体的部分组织或器官来进行繁殖的方式。特点：不发生遗传重组，后代与亲代在遗传上完全一致优点：短期内获得大量的后代

植物组织培养的理论基础植物细胞全能性(totopotent)理论：植物体的每一个细胞都含有整株植物的全部遗传信息，都有分化成一个完整植株的潜在能力。

植物组织培养的理论基础细胞分化(differentiation)：细胞后代在形态结构和功能上发生差异的过程。细胞在分化过程中，经历全能性-多能性-单能性-成熟定型细胞分化的细胞一般不在分裂分化表现在细胞多个方面的差异

植物组织培养的理论基础细胞的脱分化(dedifferentiation)：分化的细胞在一定条件下，可以转变为胚性细胞，重新获得分裂能力。愈伤组织：脱分化的细胞经过细胞分裂，产生无组织结构、无明显极性、松散的细胞团静止细胞被活化：代谢活动迅速增加、细胞质增加、胞质流动活跃、核糖体大量累积、蛋白质合成旺盛、RNA含量迅速增加。植物组织培养的理论基础细胞的再分化和器官发生细胞的再分化(redifferentiation)：脱分化后的分生细胞在一定条件下，重新分化为各种类型的细胞，并进一步发育成完整植株愈伤组织再分化形成再生植株的途径：器官发生途径：愈伤组织诱导形成器官，再形成完整植株（先根后芽或先芽后根）胚状体发生途径：由愈伤组织诱导形成类似种子的胚的结构，同时产生芽端和根端的结构，称胚状体。经过与合子胚相似的发育过程，形成完整植株。

植物组织培养的理论基础胚状体类型体细胞胚、生殖细胞胚

植物组织培养的理论基础分化期细胞在生理、生化方面有剧烈的变化酶的活性增强、营养物质累积、RNA和组蛋白的合成速度加快分化期细胞的形态大小保持相对稳定，愈伤组织不再增殖，细胞由平周分裂转变为组织内部局部的分裂，形成“瘤状”或“片状”的分生组织结构。

植物组织培养的理论基础影响植物细胞脱分化和再分化的因素内部因子：遗传性状、生理状况外部因子：营养条件、环境条件植物组织培养的理论基础植物激素在植物细胞分化和再分化中的作用激素在细胞分化中起着重要的有时是决定性的作用生长素是植物脱分化培养基中不可缺少的成分生长素作用机制：可以与组蛋白结合，活化相关基因的表达，启动细胞分裂2，4-D作用：启动细胞脱分化，形成胚性细胞团广泛应用于诱导各种愈伤组织的培养基中细胞分裂素作用：能够维持并促进脱分化细胞分裂

植物组织培养的理论基础植物激素在植物细胞分化和再分化中的作用生长素、分裂素是植物细胞再分化中不可缺少的激素生长素能促进植物根的形成并抑制芽的形成生长素/细胞分裂素的比例，影响愈伤组织的生长和器官的发生植物组织培养的理论基础其它影响植物细胞脱分化和再分化的条件机械和生理隔离对植物细胞的脱分化和再分化非常重要原因：植物离体培养将培养的细胞、组织、器官从植物体上分离下来，解除制约，从而使之恢复到分生组织状态切割创伤诱导产生的一些物质也可能影响到基因的表达，改变植物的代谢途径，朝向胚性细胞的方向发展

植物组织培养植物组织培养：在含有营养物质及植物生长物质的培养基中，培养离体植物组织并诱导使其长成完整植株的技术。

植物组织培养离体培养的细胞、组织或器官发育成完整植株方式体细胞胚胎发生器官形成

实验材料的清洗和消毒清洗自来水流水冲洗5分钟，用中性洗衣粉液清洗，自来水流水冲洗30分

实验材料的清洗和消毒消毒：药剂灭毒法适用：培养材料的表面消毒药剂选择：根据培养材料的特点，选择适合的药剂种类、浓度、消毒时间消毒原则：即达到灭菌的目的，又不能损伤植物组织和细胞各种药剂的使用浓度和浸泡时间应依据植物种类和取用的器官部位不同进行灭菌实验材料的清洗和消毒具体情况：具有较厚蜡质和角质层的材料，在药剂灭菌时加入少量表面活性剂器官外植体灭菌，一般采用多种药剂配合使用的方法如果外植体较硬较大，容易操作，可直接用灭菌剂处理未成熟胚珠、胚或胚乳，分别把子房或胚珠进行表面消毒，然后在无菌条件下把外植体解剖出来

实验材料的清洗和消毒具体情况：柔嫩的茎尖、花粉粒，茎芽、花蕾表面消毒，无菌条件下取出外植体杀菌剂处理之前，先用75%的酒精浸泡30秒，或在消毒溶液里加几滴表面活化剂，提高杀菌效果表面消毒处理后，必须在无菌蒸馏水中漂洗3-4次，除掉残留的杀菌剂外植体表面污染严重，须先用流水冲洗1小时或更长时间

培养基是植物细胞、组织、器官离体培养所需的营养物质，含有植物细胞生长分化所必须的各种营养成分和生长调节物质。对培养基成分的筛选和优化是植物组织培养中非常重要步骤

培养基早期的植物组织培养基是White提出的培养基和Gautheret提出的愈伤组织培养基，由用于整体植物栽培的营养液发展来以后所有的各种培养基都是建立在White培养基和Gautheret培养基基础上的。

培养基培养基的组成无机营养成分大量元素：氮、磷、硫、钙、钾、镁>0.5mmol/L微量元素：铁、锰、铜、锌、硼、钼<0.5mmol/L常用培养基组分上的主要差别：各种盐或离子数量上的不同各种植物组织所需要的无机盐营养在质上是相当一致的。培养基中的活性因子就是这些离子

培养基培养基的组成无机营养成分铁：Fe·EDTA无机氮：硝酸盐、铵盐

培养基-有机营养成分植物离体细胞分裂和分化所必需的有机碳、氢、氮、能量是以糖类、氨基酸、维生素的形式提供的。碳源：最常用的碳源是蔗糖，浓度2%-5%含氮物质：维生素（硫胺素、吡哆醇、烟酸、泛酸钙、肌醇）；化学成分不明的复杂营养混合物（椰子汁、玉米胚乳、麦芽浸出物、番茄汁、酵母浸出物）

培养基-植物激素类生长素自然界中，影响茎和节间的生长、向性、顶端优势、叶片脱落、生根；组织培养中用于诱导细胞的分裂和根的分化常用的生长素：IAA(吲哚乙酸)、IBA(吲哚-3-丁酸)、NAA(萘乙酸)、2，4-D(二氯苯氧乙酸)等

培养基-植物激素类细胞分裂素类自然界中，影响细胞分裂、顶端优势的分化和茎的分化组织培养中，促进细胞分裂和由愈伤组织或器官上分化不定芽常用细胞分裂素：BAP(卞氧基嘌呤)、激动素等赤霉素刺激在培养中形成的不定胚正常发育成小植株常用的是GA3

培养基-琼脂琼脂是一种由海藻得来多糖类物质。琼脂的一般使用浓度是0.7%-1%琼脂并非培养基中必需成分

培养基的选择不同的试验体系需要不同的培养基，一种适合某种培养目的的培养基成分，一般是在已被广泛采用的基本培养基的基础上，经过一系列的实验确定的试验生长调节物质最佳组合：生长素、细胞分裂素确定培养基盐分浓度确定适合的蔗糖浓度

培养基的制备市售培养基干粉按照配方规定的数量分别称量出各种成分，分别溶解于水，然后再混合在一起先配制一系列的浓缩储备液（母液），包括大量元素、微量元素、铁盐、除蔗糖外的有机物质

培养基的制备步骤称量琼脂和蔗糖，加热溶解加入一定量的各种储备液加蒸馏水至终体积调节PH值分装包装、灭菌保存

培养基的灭菌高压蒸汽灭菌：适用于固体培养基过滤除菌：适用于液体培养基

接种经过表面灭菌的实验材料，按照不同的要求，移植培养基上培养的过程。步骤消毒无菌水清洗无菌器具切取外植体接种到培养基

种质保存

许多植物的组织培养物在液氮中超低温保存以后，仍然能保持很高的存活率，并且能再生出新植株和保持原来的遗传特性保存方法材料的选择，预处理，降温冰冻，解冻，活力测定，再培养

种质保存超低温保存的意义：能保持细胞培养物的稳定性长期保存植物的种质资源长期保存农作物的优良品种及其育种亲本材料的种质

植物细胞的大规模培养技术植物细胞大规模培养的产业化前景植物细胞的大规模培养系统搅拌式生物反