《疫苗研发与制备实验》课件

疫苗研发与制备实验欢迎参加疫苗研发与制备实验课程。本课程将带领学生深入了解疫苗开发的全过程，从基础理论到实际操作技能。通过系统学习和实验实践，你将掌握现代疫苗研发的关键技术和方法。在当今全球卫生挑战日益复杂的背景下，疫苗研发能力对于应对新发和再发传染病至关重要。本课程旨在培养未来的疫苗研究人才，为保障人类健康贡献力量。让我们一同探索疫苗科学的奥秘，掌握这一关键生物技术领域的核心知识和技能。课程概述课程目标掌握疫苗研发的基本原理和流程，熟悉主要疫苗类型的制备方法，具备疫苗质量控制与评价的基本能力，能够独立完成简单疫苗的实验室制备。学习内容课程包括理论讲授和实验操作两部分，涵盖疫苗概论、研发流程、生产工艺、质量控制、安全性评价和三个核心实验课程（灭活疫苗、重组蛋白疫苗制备及质量检测）。考核方式期末理论考试（40%）、实验操作考核（30%）、实验报告（20%）和课堂表现（10%）。要求掌握理论知识同时具备实际操作能力，强调实验态度和实验室安全意识。第一章：疫苗概论疫苗的基本概念了解疫苗的定义、分类及历史发展，掌握免疫学基础知识免疫反应机制学习疫苗诱导免疫应答的基本原理，包括体液免疫和细胞免疫疫苗技术基础掌握疫苗设计和制备的基本技术路线，了解不同类型疫苗的特点疫苗的公共卫生意义认识疫苗在传染病预防与控制中的重要作用及全球健康贡献疫苗的定义和分类按制备方法分类灭活疫苗：完全杀死的病原体减毒活疫苗：减弱毒力的活病原体亚单位疫苗：病原体的特定成分毒素类疫苗：灭活的细菌毒素按技术平台分类重组蛋白疫苗：表达的特定抗原病毒载体疫苗：利用其他病毒携带目标抗原核酸疫苗：DNA或RNA编码抗原病毒样颗粒：模拟病毒结构但无遗传物质按免疫机制分类预防性疫苗：预防特定疾病感染治疗性疫苗：治疗已存在的疾病粘膜免疫疫苗：激活粘膜局部免疫多价/联合疫苗：预防多种疾病疫苗的发展历史1古代预防接种公元前1000年，中国和印度等地开始使用人痘接种法预防天花，通过将轻症患者的痘痂研磨后吸入鼻腔或接种于皮肤，是最早的免疫实践。2杰纳与牛痘1796年，英国医生爱德华·杰纳发明世界上第一种现代疫苗——牛痘接种，通过接种牛痘病毒预防天花，开创了现代疫苗学的先河。3巴斯德时代19世纪后期，路易·巴斯德发明了减毒活疫苗技术，成功研制出狂犬病和炭疽疫苗，建立了减毒疫苗的理论基础。4分子生物学革命20世纪后期至今，基因工程、分子生物学技术推动疫苗进入新时代，出现了重组蛋白疫苗、核酸疫苗等新型平台，疫苗设计更加精准和安全。疫苗的作用机制疫苗接种将含有抗原的疫苗制剂通过注射、口服或吸入等方式引入人体抗原递呈抗原被抗原递呈细胞(APCs)摄取、加工并呈递给T细胞免疫识别T细胞被激活并协助B细胞识别抗原产生抗体反应免疫记忆形成记忆性B细胞和T细胞，在再次接触病原体时能快速响应疫苗的重要性200万+年均减少死亡全球范围内，疫苗每年预防约200-300万人死亡80%麻疹死亡率降低自2000年以来，麻疹疫苗使全球麻疹死亡率下降了80%以上99.9%脊髓灰质炎减少率自1988年以来，全球脊髓灰质炎病例减少了99.9%20:1投资回报比疫苗免疫规划的经济回报率约为20:1，是最具成本效益的公共卫生干预措施之一第二章：疫苗研发流程上市与监测疫苗获批上市后持续进行上市后监测临床研究I、II、III期临床试验评估安全性和有效性临床前研究在动物模型中进行安全性和免疫原性测试候选疫苗筛选筛选和优化潜在的候选疫苗靶标识别确定病原体上的关键抗原和免疫表位疫苗研发的基本步骤基础研究开展病原体分子生物学和免疫学研究，了解致病机制、免疫逃逸特性，寻找可能的保护性抗原。这一阶段通常在大学和研究所的实验室进行，需要2-5年时间。抗原设计与筛选基于基础研究结果，设计和筛选能够引起保护性免疫应答的抗原。可能采用多种技术平台进行候选疫苗的制备，包括重组蛋白、减毒、灭活、载体等方法。临床前评价在细胞和动物模型中评估疫苗的安全性、免疫原性和有效性。进行动物毒理学研究，确定首次人体试验的安全剂量范围。同时开始研究疫苗的生产工艺和质控方法。临床试验按照I、II、III期临床试验设计，逐步在人体中评价疫苗的安全性、免疫原性和保护效力。III期试验通常需要招募数千至上万志愿者，观察期可能长达数年。注册审批与上市向药品监管机构提交完整的研发数据，申请疫苗注册上市。批准后建立上市后监测系统，持续收集疫苗在大规模人群中使用的安全性和有效性数据。靶标选择与抗原设计靶标选择原则针对病原体保守区域具有良好免疫原性能诱导中和抗体或保护性T细胞应答结构稳定易于制备在病原体生命周期中具有关键功能抗原设计策略结构生物学指导：利用冷冻电镜、X射线晶体学等技术解析抗原三维结构，精确设计表位反向疫苗学：从康复者血清中分离高效中和抗体，逆向推导理想抗原计算生物学：通过生物信息学预测抗原表位，优化抗原序列和结构多表位抗原：整合多个保守表位增强保护广谱性候选疫苗筛选体外评价细胞水平评估抗原表达、构象完整性和稳定性初步动物免疫小鼠等小型动物模型中评估免疫原性非人灵长类动物试验评价保护效力与安全性候选疫苗筛选是研发过程中的关键环节，通常需要对多个候选物进行平行评估。体外评价包括抗原纯度测定、抗原-抗体结合力测定和稳定性分析。动物模型中主要检测抗体滴度、中和活性、T细胞应答及攻毒后的保护效力。筛选过程使用的评价指标包括：血清学指标（抗体滴度、中和活性）、细胞免疫指标（T细胞增殖、细胞因子分泌）、保护效力指标（攻毒后的发病率、死亡率）和安全性指标（局部反应、系统反应）。最终，综合考虑有效性、安全性和可生产性，选择最佳候选疫苗进入后续研发阶段。临床前研究安全性评价一般毒性试验：评估疫苗在动物体内的急性、亚急性和慢性毒性特殊毒性试验：生殖毒性、致癌性、免疫毒性等局部耐受性：研究注射部位的组织反应药效学研究免疫原性：评价疫苗诱导抗体和T细胞免疫应答的能力保护效力：动物攻毒试验评估疫苗的保护效力免疫机制：探究疫苗产生保护作用的分子免疫学机制药代动力学疫苗成分在体内的分布、代谢和排泄特性佐剂的体内分布和清除规律抗原在接种部位的滞留时间和淋巴结运输情况临床试验阶段试验阶段研究目的样本量持续时间I期临床试验初步评价安全性和耐受性，确定适宜剂量20-100人数月II期临床试验进一步评价安全性，初步评价免疫原性和保护效力数百人6-12个月III期临床试验大规模评价疫苗有效性和安全性数千至数万人1-4年IV期临床试验上市后监测，评价真实世界效果和长期安全性数十万至数百万人多年疫苗注册与上市申报资料准备完整的临床前和临床研究资料生产工艺和质量控制体系文件稳定性研究数据技术审评药监部门对研发和生产数据进行全面审评必要时现场核查和样品检验批准上市获得生物制品批准证明文件生产许可和上市销售批文上市后监测不良反应监测系统有效性和安全性持续评估第三章：疫苗生产工艺上游工艺包括细胞培养、病毒培养或发酵等过程，是抗原的生产阶段。此阶段需要严格控制培养条件，以获得高产量和稳定质量的抗原。下游工艺包括收获、纯化、灭活等步骤，目的是获得高纯度的抗原组分。采用层析、过滤、沉淀等方法去除杂质，同时保持抗原的完整性和活性。制剂工艺将纯化的抗原与佐剂、稳定剂等辅料混合，制备成最终剂型。此阶段关键是保证均质性、无菌性和稳定性，通常包括配制、灌装、冻干等工艺步骤。细胞培养技术贴壁细胞培养适用于原代细胞和某些连续传代细胞系静态培养：T瓶、细胞工厂、多层细胞培养瓶微载体培养：细胞附着在微球表面生长中空纤维反应器：细胞附着在半透膜表面优点：模拟体内环境，细胞形态和功能保持良好缺点：放大难度大，单位体积产量低悬浮细胞培养适用于某些工程化细胞系和昆虫细胞摇瓶培养：实验室小规模培养搅拌罐生物反应器：大规模工业化生产气升式生物反应器：无机械搅拌，减小剪切力优点：易于大规模放大，过程控制简便缺点：剪切力可能损伤某些敏感细胞病毒培养与收获宿主细胞准备培养适合的宿主细胞至适当密度和状态病毒接种以适当的感染复数(MOI)接种病毒病毒增殖控制培养条件使病毒高效复制病毒收获最佳时间收获含病毒的培养基或细胞抗原纯化技术初步处理离心：去除细胞碎片和大颗粒杂质过滤：使用深层过滤或切向流过滤去除颗粒沉淀：用硫酸铵或PEG沉淀目标抗原中间纯化离子交换层析：基于分子表面电荷分离疏水相互作用层析：基于分子表面疏水性分离分子筛层析：基于分子大小分离精细纯化亲和层析：利用特异性结合实现高纯度分离超滤/透析：去除小分子杂质和溶剂交换多模式层析：结合多种分离机制提高纯度灭活与减毒技术化学灭活法甲醛灭活：经典方法，用于百白破、脊灰等疫苗β-丙内酯灭活：反应快，残留少，用于狂犬病疫苗二乙基吡碳酸酯：适用于某些热敏感病毒过氧化氢：氧化作用灭活，残留物为水和氧物理灭活法紫外线照射：表面灭活，穿透力有限γ射线照射：穿透力强，可用于最终产品灭菌热处理：对某些病毒有效，但可能影响抗原性高压处理：保持抗原结构完整性减毒技术传代减毒：在非自然宿主细胞中连续传代冷适应：在低温下培养产生温度敏感突变株基因重配：重组病毒基因组产生减毒株定向基因突变：定点修改毒力基因佐剂选择与配制铝佐剂包括氢氧化铝凝胶和磷酸铝，是最常用的佐剂。通过形成沉淀物延长抗原释放，并促进抗原被抗原呈递细胞摄取。主要增强体液免疫反应，安全性好但免疫增强作用有限。乳剂佐剂包括油包水(w/o)和水包油(o/w)乳剂。MF59和AS03是应用较广的o/w乳剂佐剂，能显著增强抗体反应和T细胞应答。油相组分一般采用角鲨烯等生物相容性好的油脂。免疫刺激剂利用病原体相关分子模式(PAMPs)激活模式识别受体，包括CpG寡核苷酸(TLR9激动剂)、单磷酰脂质A(TLR4激动剂)等。能够模拟自然感染过程，诱导更强的先天和适应性免疫反应。纳米载体包括脂质体、聚合物微粒等，能够保护抗原、靶向递送和控制释放。新型脂质纳米颗粒在mRNA疫苗中发挥关键作用，提高了mRNA的稳定性和细胞摄取效率。制剂工艺配方设计根据抗原特性和免疫需求选择合适的辅料配制与过滤将抗原与辅料混合并进行无菌过滤灌装与冻干精确灌装到最终容器并进行冻干(如需)疫苗制剂工艺是确保最终产品质量的关键环节。配方设计需考虑抗原稳定性、免疫效果和使用便利性。常用辅料包括稳定剂(蔗糖、海藻糖)、缓冲剂(磷酸盐缓冲液)、保护剂(明胶、人血白蛋白)和防腐剂(硫柳汞或酚)。灌装过程在洁净环境中进行，需严格控制微粒和微生物污染。对热敏感抗原，冻干工艺可提高产品稳定性和货架期。冻干周期包括冻结、一次干燥和二次干燥，每个阶段的参数设置对产品质量至关重要。最后进行包装和批号管理，确保产品可追溯性。第四章：疫苗质量控制最终放行完整批次审核后获批放行2成品检测安全性、效力、纯度、稳定性等全面评价过程控制关键工艺参数监测和中间品检测原材料控制确保所有起始物料符合质量标准原材料质量控制材料类型关键质量属性检测方法细胞基质无菌性、支原体、细胞特性、基因稳定性微生物检测、细胞鉴定、核型分析培养基和血清无菌性、生物活性、内毒素、病毒污染微生物培养、LAL试验、病毒检测种子批纯度、效价、遗传稳定性、鉴别PCR、测序、效价测定辅料纯度、无菌性、理化特性化学分析、微生物限度试验包装材料完整性、相容性、保护性物理测试、提取物试验、密封性测试生产过程质量控制上游工艺控制细胞培养参数：pH值、溶氧、温度、搅拌速度细胞生长指标：细胞密度、活率、代谢物分析感染效率：CPE观察、病毒滴度测定工艺一致性：批次间变异控制下游工艺控制纯化效率：杂质去除率、产品回收率纯度检测：蛋白纯度、宿主细胞蛋白含量病毒灭活/去除验证：残留活病毒检测产品特性：分子量、蛋白构象、抗原性制剂工艺控制配方均质性：成分分布均匀性无菌过滤：完整性测试、生物负载灌装精度：装量差异控制冻干参数：冻干曲线、残留水分成品质量控制鉴别试验确认产品的特异性和真实性，通常采用免疫学方法（ELISA、免疫扩散）或分子生物学方法（PCR、测序）进行。这一测试可以区分不同的疫苗产品，防止混淆。无菌与纯度试验包括无菌检查、支原体检测、细菌内毒素试验、残留宿主细胞蛋白检测、残留DNA检测、异常毒性试验等。这些测试确保产品不含有害杂质和污染物。效力检测评估疫苗的生物学活性，通常包括体外抗原含量测定和体内效力测定两种方法。体内效力测定可通过动物攻毒保护试验或免疫原性指标（如抗体滴度）进行评价。物理化学检查包括外观、可见异物、pH值、渗透压、装量、铝含量、蛋白含量、残留试剂、水分等指标。这些指标反映了产品的物理化学稳定性和制剂质量。稳定性研究稳定性研究类型实时稳定性研究：在推荐储存条件下进行，通常持续至超过预期有效期加速稳定性研究：在高于推荐条件下进行，加速降解过程压力试验：在极端条件下评估产品敏感性冻融循环研究：评估冻融对稳定性的影响光照稳定性：评估光照对产品质量的影响关键稳定性指标物理指标：外观、颗粒大小、pH值、渗透压、可复溶性化学指标：含量、杂质、降解产物、佐剂吸附率生物学指标：效力、抗原性、免疫原性微生物学指标：无菌性、保存剂效力影响因素温度、光照、湿度、氧气、包装材料相容性、冻融循环第五章：疫苗安全性评价体外安全性评价利用细胞培养系统评估产品的细胞毒性、细胞功能影响和基因毒性等，减少动物使用的替代方法。常用技术包括细胞活力检测、染色体畸变分析和微核试验等。动物安全性评价在实验动物模型中评价产品的急性毒性、重复给药毒性、生殖发育毒性以及局部耐受性等。通过观察动物的生理、行为和病理变化，确定产品的安全剂量范围。临床安全性评价在严格设计的临床试验中，通过评估不良事件的发生率和严重程度，确定产品在人体使用的安全性特征。临床试验后还需进行长期的上市后安全性监测。毒性试验1急性毒性试验评估单次大剂量给药后的毒性反应。通常使用两种哺乳动物（如小鼠和大鼠），给药量为临床剂量的多倍，观察2周内的死亡率、行为变化和体重变化等指标。2重复给药毒性试验模拟临床多次给药方案，评估长期接种的安全性。实验周期根据临床方案而定，通常4-6周，观察动物的临床症状、血液学、生化、免疫学和病理学指标变化。3特殊毒性试验包括生殖发育毒性（评估对生殖能力和后代发育的影响）、免疫毒性（评估对免疫系统功能的影响）、神经毒性（评估对神经系统的影响）等针对特定器官或系统的专项毒性研究。4局部耐受性试验评估疫苗在接种部位的局部反应，包括疼痛、红肿、硬结等。观察接种部位的组织病理学变化，确定局部反应的严重程度和持续时间。过敏原性试验全身性过敏反应试验使用豚鼠或小鼠进行主动全身过敏反应试验，首先用疫苗免疫动物，然后给予激发剂量，观察是否出现过敏反应症状。指标包括体温变化、呼吸困难、循环系统变化、死亡率等，评估疫苗诱导即时型超敏反应的风险。被动皮肤过敏反应试验将免疫动物的血清注射到另一只动物的皮肤内，24小时后静脉注射抗原和伊文思蓝，观察注射部位是否出现蓝色斑点（皮肤过敏反应）。此方法可检测疫苗诱导的IgE型抗体产生。局部淋巴结试验评价疫苗成分的迟发型过敏潜力，测量疫苗局部接种后引起的淋巴结细胞增殖反应。技术操作较简单，可减少动物使用，是评价过敏原潜力的替代方法。抗原特异性IgE检测通过ELISA或流式细胞术等技术检测免疫动物血清中抗原特异性IgE抗体水平，直接评价疫苗诱导过敏反应的可能性。此方法更加精确，可与传统方法互为补充。免疫原性试验体液免疫评价抗体滴度检测：使用ELISA、血凝抑制试验、中和试验等方法测定特异性抗体水平抗体功能检测：中和抗体活性、黏附抑制能力等抗体亚型分析：评估不同IgG亚型的比例，反映免疫反应的类型B细胞应答：通过ELISPOT检测抗原特异性B细胞数量免疫记忆：评估长期抗体水平和记忆B细胞应答细胞免疫评价T细胞增殖：通过MTT或CFSE染色检测抗原刺激下的T细胞增殖反应细胞因子检测：使用ELISA、流式细胞术或qPCR测定细胞因子表达谱CTL活性：细胞毒性T淋巴细胞杀伤活性测定T细胞表型分析：CD4+/CD8+比例和记忆T细胞标记物检测ELISPOT：检测分泌特定细胞因子的细胞数量效力评价试验免疫接种按临床方案给动物接种疫苗攻毒挑战用致病性病原体感染免疫动物指标观察临床症状、病毒载量、器官病理等保护评价计算保护率和相对效力指数第六章：实验室安全与管理生物安全管理体系全面的安全管理制度与责任落实人员安全防护培训、个人防护装备和安全操作规程设施工程控制物理隔离和环境控制系统风险识别与评估明确危害因素与防控策略生物安全等级与防护安全等级适用微生物主要防护要求BSL-1对健康成人无致病性微生物基本实验室操作和洗手盆BSL-2对人有中等危害的微生物限制进入，生物安全柜，个人防护装备BSL-3可能经空气传播的致病微生物受控进入，负压环境，双层门，HEPA过滤BSL-4致命且无有效治疗手段的微生物气密门，专用供气系统，正压防护服，化学淋浴实验室设施与设备要求基础设施要求实验区与办公区严格分离，不同安全等级区域物理隔离。根据BSL等级配备相应的通风系统、气闸门和压力梯度控制系统。地面和墙面应防渗透、易清洁、耐腐蚀。配备应急淋浴设施、洗眼器和防火设备。关键设备配置生物安全柜：根据操作微生物种类选择I级、II级A2/B2型或III级。高压灭菌器：用于实验废弃物处理，最好采用双门通道式。冷冻设备：-80℃超低温冰箱保存菌毒种和样本。离心机：带密闭转子或气溶胶密封装置的高速离心机。设备验证与维护新设备必须进行安装确认(IQ)和运行确认(OQ)，定期进行性能确认(PQ)。生物安全柜需每年进行HEPA过滤器完整性测试和气流测试。高压灭菌器需定期进行温度分布验证和生物指示剂验证。维护记录和校准证书必须完整存档。实验操作规范通用安全操作规程实验室门应保持关闭，未经授权人员禁止入内。实验区禁止饮食、吸烟和化妆。所有操作应避免产生气溶胶。离开实验区前必须洗手。使用机械吸管，禁止口吸。工作台面在工作前后应当消毒。个人防护要求进入实验室必须穿着专用实验服，不得穿着实验服离开实验区。根据风险评估佩戴适当的手套、护目镜、口罩或呼吸防护装置。长发应束起，避免佩戴首饰。离开实验室前更换个人防护装备。高风险操作防护所有可能产生气溶胶的操作（如离心、混匀、超声处理）必须在生物安全柜内进行。使用尖锐物品时应格外小心，避免针刺伤。活病毒操作必须在适当安全等级实验室进行，并遵循具体标准操作程序。意外事件处理针对溢洒、设备故障、人员暴露等情况制定应急预案。每个实验室必须配备溢洒处理工具包和相应消毒剂。发生意外暴露后的医疗处置流程应明确，并定期进行应急演练。所有事故需详细记录并报告。废弃物处理废弃物分类感染性废弃物：含有活微生物的材料锐器废弃物：针头、刀片、碎玻璃化学废弃物：有毒、腐蚀性化学品一般实验室垃圾：无特殊危害的废弃物收集与存放使用专用容器分类收集，明确标识生物危险废物使用防泄漏、防穿刺容器锐器必须放入防穿刺容器化学废液分类收集，避免混合处理与灭活生物废弃物高压灭菌(121℃,30分钟)部分废弃物可用化学消毒剂处理化学废弃物按环保要求特殊处理放射性废弃物遵循放射防护规定最终处置与有资质的专业机构签订处置合同建立完整的废弃物转移记录确保处置过程可追溯定期审核处置机构资质第七章：实验内容（一）：灭活疫苗制备实验内容概述病毒种子扩增与培养病毒收获与纯化方法β-丙内酯灭活工艺灭活效果验证佐剂配制与乳化疫苗制剂配制技术要点无血清培养基优化最佳病毒收获时间确定灭活剂浓度与时间控制抗原纯度与含量测定佐剂乳化均匀性评价疫苗稳定性检测关键设备生物反应器切向流过滤系统高速离心机色谱纯化系统高压均质机病毒效价测定仪器实验目的与原理实验目的掌握灭活疫苗制备的基本流程和关键技术。了解病毒培养、收获、纯化、灭活及制剂的全过程。培养无菌操作技能和生物安全意识。学习疫苗质量检测的基本方法。灭活疫苗原理灭活疫苗是通过化学或物理方法使病原体失去感染力但保留免疫原性的疫苗。灭活过程必须完全杀灭病原体，同时尽可能保留其抗原结构完整性。常用灭活剂包括甲醛、β-丙内酯等。免疫保护机制灭活疫苗主要通过诱导体液免疫（抗体反应）产生保护效力。由于缺乏活病原体复制过程，通常需要多次免疫和添加佐剂增强免疫反应。添加的佐剂可刺激先天免疫系统，增强后续适应性免疫反应。实验材料与仪器实验材料细胞系：Vero细胞（非洲绿猴肾细胞）病毒种子：减毒流感病毒株培养基：DMEM/F12，补充2%胎牛血清灭活剂：0.05%β-丙内酯(BPL)纯化试剂：蔗糖梯度液，PBS缓冲液佐剂系统：氢氧化铝凝胶灭菌耗材：移液器吸头，离心管，无菌烧瓶检测试剂：TCID50测定试剂盒，蛋白质定量试剂实验仪器生物安全柜（II级）：用于所有涉及活病毒的操作CO2培养箱：维持37℃,5%CO2条件离心机：配备生物安全转子切向流过滤系统：浓缩和脱盐超速离心机：病毒纯化高效液相色谱仪：蛋白纯度分析酶标仪：ELISA测定细胞计数器：细胞密度和活率测定高压灭菌器：材料灭菌和废弃物处理冷冻干燥机：样品冻干（可选）实验步骤：病毒培养细胞准备从液氮中复苏Vero细胞，在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养。使用0.25%胰蛋白酶消化传代，扩增至足够数量。接种细胞密度控制在2-3×10^6/ml，培养至80-90%汇合度。实验前24小时将培养基更换为无血清培养基，降低后续纯化难度。病毒接种在生物安全柜中操作，将工作种子病毒按照0.01-0.1的感染复数(MOI)接种到准备好的细胞培养瓶中。轻轻摇匀，确保病毒均匀分布。37℃吸附1-2小时，期间每15-20分钟轻轻摇动培养瓶，促进病毒吸附。病毒培养吸附结束后，加入无血清维持培养基。维持培养基中添加适量胰蛋白酶(2-5μg/ml)，促进病毒释放。将培养瓶置于37℃,5%CO2培养箱中培养。每天观察细胞病变效应(CPE)，记录CPE发展情况。培养参数监测定期取样检测pH值、葡萄糖消耗、乳酸生成和氨基酸利用情况。使用血凝试验或RT-PCR法监测病毒滴度变化。当CPE达到75-80%时（通常培养48-72小时），收获病毒液。如有必要，在收获前补充营养物质，提高病毒产量。实验步骤：病毒收获与纯化病毒收获CPE达75-80%时收获病毒液低温条件下操作(4℃)加入蛋白酶抑制剂保护病毒抗原澄清与过滤低速离心(2000×g,20分钟)去除细胞碎片0.45μm滤膜过滤除去大颗粒记录病毒液体积和性状浓缩与脱盐切向流过滤(TFF)浓缩10-20倍使用100kDa截留分子量膜缓冲液置换5-7次脱盐密度梯度纯化制备10-50%蔗糖梯度超速离心(28000rpm,3小时)收集含病毒的条带PBS透析去除蔗糖实验步骤：病毒灭活灭活前准备测定病毒浓度，调整至适宜浓度1灭活剂添加加入0.05%β-丙内酯，慢速搅拌2灭活反应4℃孵育24小时，后37℃水浴2小时灭活验证细胞培养法验证灭活完全性实验步骤：佐剂添加与制剂1抗原含量测定使用BCA法或紫外吸收法测定蛋白含量。用ELISA或SRID方法测定特异性抗原含量。根据测定结果计算所需抗原量，疫苗中抗原含量通常为15-45μg/剂。2佐剂准备准备2%氢氧化铝凝胶悬浮液，灭菌过滤备用。配制含0.01MPBS(pH7.2)的稀释缓冲液。根据抗原理化性质决定是否需要调整凝胶pH值。3抗原吸附将抗原溶液缓慢滴加到搅拌中的佐剂悬浮液中，控制滴加速率。室温下搅拌2小时完成吸附过程。吸附后4℃静置过夜，增加吸附效率。4制剂配制加入适量保护剂(如0.5%人血白蛋白)。添加防腐剂(如0.01%硫柳汞)。调整等渗性和pH值。无菌条件下分装于灭菌西林瓶中，每瓶0.5ml。贴标签注明批号、剂量和失效日期。实验数据记录与分析记录项目记录内容分析方法细胞培养数据细胞密度、活率、形态、传代次数增长曲线分析，细胞生长参数计算病毒培养数据CPE进展，病毒滴度，收获时间最佳收获时间分析，病毒产量计算纯化过程数据回收率，纯度，浓度变化纯化效率评价，损失原因分析灭活效果数据灭活前后病毒活性，安全性验证结果灭活动力学分析，灭活完全性评价制剂特性数据抗原含量，吸附率，pH值，外观产品质量一致性评价，佐剂效应分析第八章：实验内容（二）：重组蛋白疫苗制备基因工程技术重组蛋白疫苗制备基于DNA重组技术，将目标抗原基因克隆到表达载体中，通过宿主细胞表达系统生产抗原蛋白。这种方法可以精确控制抗原设计，避免使用活病原体，显著提高安全性。表达系统选择根据目标蛋白特性选择适当的表达系统，常用的包括大肠杆菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞。每种系统有其优缺点，影响蛋白折叠、翻译后修饰和产量。本实验将使用大肠杆菌系统表达相对简单的病毒抗原蛋白。生产工艺重组蛋白疫苗的生产工艺包括基因克隆与表达、蛋白纯化、蛋白特性分析和制剂配方研究。与传统疫苗相比，重组技术可以实现大规模、标准化生产，具有良好的批次一致性和可控性。实验目的与原理实验目的掌握重组蛋白疫苗制备的基本流程和关键技术。学习基因克隆、蛋白表达、纯化和鉴定的实验方法。了解疫苗抗原的分子设计原则和质量控制要点。培养分子生物学和蛋白质工程的实验技能。基因重组原理利用分子克隆技术，将编码目标抗原的基因序列插入到表达载体中，构建重组表达质粒。表达载体通常含有强启动子、多克隆位点、选择标记和标签序列等功能元件。通过转化将重组质粒导入宿主细胞，利用宿主细胞的转录翻译系统表达目标蛋白。蛋白表达与纯化原理通过诱导条件激活表达载体上的启动子，使目标基因大量转录翻译。表达的重组蛋白可能以可溶形式存在于胞质或培养基中，也可能形成包涵体。利用亲和层析、离子交换、分子筛等技术分离纯化目标蛋白。通过标签技术(如His标签)简化纯化过程。实验材料与仪器生物材料目标基因：乙型肝炎表面抗原(HBsAg)基因载体：pET28a表达载体(含His标签)菌株：大肠杆菌BL21(DE3)限制性内切酶：BamHI和XhoIT4DNA连接酶PCR扩增试剂盒质粒提取试剂盒蛋白纯化树脂：Ni-NTA琼脂糖抗体：抗HBsAg单克隆抗体主要仪器设备PCR仪：基因扩增电泳系统：DNA和蛋白分析凝胶成像系统：电泳结果分析恒温摇床：菌种培养超声破碎仪：细胞破碎高速冷冻离心机：样品分离蛋白纯化系统：ÄKTA纯化系统超滤离心管：蛋白浓缩分光光度计：蛋白浓度测定Westernblot系统：蛋白鉴定实验步骤：基因克隆与表达1目标基因扩增设计含有BamHI和XhoI限制性酶切位点的引物。以乙肝病毒基因组为模板，PCR扩增HBsAg基因片段。反应条件：预变性94℃5分钟，30个循环(94℃30秒，58℃30秒，72℃1分钟)，终延伸72℃10分钟。琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物，切胶回收目标条带。2载体构建PCR产物和pET28a载体分别用BamHI和XhoI双酶切，37℃4小时。酶切产物凝胶电泳纯化。以1:3的摩尔比(载体:插入片段)设置连接反应，16℃过夜。连接产物转化至DH5α感受态细胞，在含卡那霉素的LB平板上筛选阳性克隆。提取质粒进行PCR和酶切验证，测序确认。3重组蛋白表达将正确的重组质粒转化至BL21(DE3)表达菌株。挑取单菌落接种到5mlLB培养基(含卡那霉素50μg/ml)，37℃培养过夜。按1:100比例接种至500ml培养基中，37℃振荡培养至OD600约0.6。加入IPTG至终浓度1mM诱导表达，16℃继续培养16-18小时。收集菌体，-80℃保存。4表达验证取少量菌液进行SDS分析，比较诱导前后的蛋白表达谱变化。根据目标蛋白的理论分子量(约24kDa加上His标签)确认表达条带。采用Westernblot进一步验证，使用抗His标签抗体和抗HBsAg抗体进行免疫检测，确认目标蛋白的表达。实验步骤：蛋白纯化细胞破碎与包涵体处理冻存菌体在裂解缓冲液(50mMTris-HClpH8.0,300mMNaCl,10mM咪唑)中重悬。超声破碎(功率300W，工作10秒，间隔10秒，共30分钟)，冰浴条件下操作。12,000×g离心20分钟分离上清和沉淀。如果目标蛋白以包涵体形式存在，需要用含8M尿素的变性缓冲液溶解包涵体，之后进行复性处理。亲和层析纯化平衡Ni-NTA琼脂糖柱(10ml)，用5倍柱体积的裂解缓冲液。将细胞裂解上清或变性复性的包涵体溶液上样至柱子，流速控制在1ml/分钟。用含20mM咪唑的洗脱缓冲液洗涤(10倍柱体积)，去除非特异结合蛋白。用含250mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱目标蛋白，收集洗脱峰。离子交换和分子筛纯化将亲和层析得到的洗脱液透析至低盐缓冲液(20mMTris-HClpH8.0)。上样至预平衡的QSepharose阴离子交换柱，使用NaCl梯度(0-1M)洗脱。收集含目标蛋白的洗脱峰，浓缩至2-5ml。将浓缩样品上样至Superdex200分子筛柱，用PBS缓冲液洗脱，收集目标蛋白单体峰。蛋白浓缩与缓冲液置换将纯化的蛋白溶液使用分子量截留值为10kDa的超滤离心管浓缩至目标浓度(通常1-5mg/ml)。同时更换为最终储存缓冲液(PBSpH7.4)。无菌过滤，分装到无菌离心管中。测定蛋白浓度(BCA法)，-80℃保存或直接用于下一步制剂配制。实验步骤：蛋白定量与鉴定蛋白质定量与鉴定是确保重组疫苗抗原质量的关键步骤。我们采用多种互补技术对纯化的HBsAg蛋白进行全面分析。首先使用BCA法和紫外分光光度法测定蛋白浓度，随后通过SDS评估纯度，使用Westernblot和ELISA确认抗原特异性，并利用质谱技术验证蛋白序列。最后，通过圆二色谱和动态光散射分析蛋白的二级结构和均一性，确保其具有正确的构象。实验步骤：佐剂添加与制剂抗原准备调整纯化蛋白浓度至0.5-1mg/ml1佐剂选择与制备准备氢氧化铝或MF59乳剂佐剂抗原-佐剂混合控制适当比例和温度进行混合吸附3辅料添加与配方优化加入稳定剂、防腐剂等辅料灌装与包装无菌条件下进行分装与标签5实验数据记录与分析蛋白表达量(mg/L)纯度(%)抗原活性(%)上图展示的实验数据表明，蛋白表达量在诱导后16小时达到峰值，约为120mg/L，此时纯度和抗原活性也达到最佳状态。继续延长培养时间至24小时，虽然蛋白产量略有增加，但纯度和抗原活性开始下降，可能是由于蛋白降解或错误折叠增加。因此，确定最佳诱导表达时间为16小时。在纯化过程中，亲和层析步骤回收率约为80%，离子交换和分子筛步骤分别为85%和90%。最终产品的总回收率约为61%，纯度达到95%以上，符合疫苗原料的质量要求。抗原活性测定显示，纯化后的HBsAg蛋白与参考标准品的结合活性相当，证明纯化过程保持了抗原表位完整性。第九章：实验内容（三）：疫苗质量检测物理化学检测外观：目视检查悬浮液均一性、颜色pH值：pH计测定蛋白含量：BCA法、紫外吸收法铝含量：原子吸收光谱法佐剂吸附率：上清分析法生物学检测无菌检查：直接接种法内毒素：鲎试验法异常毒性：动物注射观察法效价测定：ELISA或动物免疫法残留病毒：细胞培养法分子生物学检测鉴别试验：PCR或免疫印迹残留DNA：qPCR法宿主细胞蛋白：ELISA法分子完整性：质谱分析蛋白构象：圆二色谱实验目的与原理实验目的掌握疫苗质量检测的基本方法和技术要点。了解无菌检查、效价测定和安全性检测的操作流程。培养疫苗质量控制的实验技能和规范意识。学习实验数据的记录、分析和结果判定方法。质量检测的意义疫苗质量检测是确保疫苗安全性和有效性的关键环节。完善的质量控制体系是疫苗从实验室到临床应用的必要保障。监管部门要求每批疫苗必须通过一系列标准化检测后才能上市。质量检测贯穿疫苗开发和生产的全过程，是保障公众健康的重要屏障。检测原理无菌检查：通过接种培养基检测疫苗中是否存在活的微生物污染。根据《中国药典》要求，采用直接接种法或薄膜过滤法，分别使用流体硫乙醇酸盐培养基(FTM)和胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)检测需氧和厌氧微生物。效价测定：根据疫苗类型采用适当方法评价其生物学活性。对于蛋白疫苗，通常通过ELISA测定抗原含量；对于灭活疫苗，可能需要动物免疫后测定中和抗体滴度；对于减毒活疫苗，则需要测定病毒感染性滴度。安全性检查：包括异常毒性试验、特异性毒性试验和接种部位反应检查等。异常毒性通过小鼠和豚鼠体重变化及临床症状评价；特异性毒性针对特定疫苗可能的特殊毒性；接种部位反应评价局部耐受性。实验材料与仪器无菌检查材料与仪器流体硫乙醇酸盐培养基(FTM)和胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)、无菌操作台、恒温培养箱(20-25℃和30-35℃)、无菌采样器具、薄膜过滤装置(0.45μm)、无菌接种环和针效价测定材料与仪器ELISA试剂盒(包括包被抗体、标准品、酶标二抗、底物)、微孔板、酶标仪、洗板机、孵育箱、精密移液器、实验动物(小鼠或豚鼠)、血清收集材料安全性检查材料与仪器SPF级小鼠和豚鼠、无菌注射器、电子天平、体温计、解剖工具、组织固定液、组织切片设备、显微镜检测样品实验制备的灭活疫苗和重组蛋白疫苗样品、阳性对照疫苗(已知效价和安全性的参考品)、阴性对照样品(仅含佐剂的制剂)实验步骤：无菌检查实验准备提前48小时检查培养基的无菌性准备无菌操作环境(层流柜)准备样品和阴阳性对照培养基预热至室温直接接种法取样品1ml分别加入10mlFTM和TSB中含油佐剂的疫苗需加入适量聚山梨酯设置无接种阴性对照和阳性菌种对照混匀后避光培养薄膜过滤法使用0.45μm滤膜过滤样品无菌PBS冲洗滤膜3次将滤膜剪成两半，分别置于FTM和TSB中混匀后避光培养结果观察与判定FTM在30-35℃培养14天TSB在20-25℃培养14天每天观察培养基澄清度变化有浑浊则可能存在微生物污染实验步骤：效价测定1灭活疫苗效