基因工程基本流程获取目的基因优品

基因工程基本流程获取目的基因1获取目的基因目的基因修饰、改良建立高效表达系统表达调控机制研究2鸟枪法cDNA法PCR扩增化学合成基因文库3鸟枪法（shotgun

）用基因组中的随机产生的片段作为模板进行克隆4“鸟枪法”最初用于测定微生物基因组序列。近年来，美国塞莱拉公司利用改进的全基因组“鸟枪法”完成了果蝇和人类基因组的测序工作，证明了它在测定大基因组上的可行性和有效性。5鸟枪法基本程序机械切割片段长度均一，大小可控，平头末端全酶切片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，大小不可控部分酶切

片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整1.目的基因组DNA片段的制备6第四步，氧化作用(oxidation)。一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目。第二步，偶联反应(coupling)。可得到10-30kb的随机片断。第二步，偶联反应(coupling)。（2）构建基因文库的载体选用在基因组文库的构建过程中，严禁外源DNA片段之间的连接。mRNA只占总RNA的1%-2%。再同不表达A蛋白的总mRNA杂交成cDNA-mRNA双链。这也就是为何我们称这种寡核苷酸合成法为磷酸三酯法的原因。如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体DNA，然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高重组子中目的重组子的出现频率mRNA只占总RNA的1%-2%。载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。化学合成DNA片断的组装第一链合成完毕后，变性去除残留的mRNA，在cDNA的游离3’末端添加OligodC，然后与人工合成的OligodG退火，形成引物结构，聚合第二条链。少数情况下，如为了使目的基因高效表达，也可选用动植物细胞:某一种低丰度mRNA占细胞整个mRNA的比例根据外源DNA片段的末端性质、筛选方案和大小确定载体片段大小λ-噬菌体、YAC、BAC……筛选方案克隆载体：原位杂交或限制性酶切图谱表达载体：基因产物功能检测2.外源DNA片段的全克隆7根据筛选方案确定受体：大肠杆菌：原位杂交或限制性酶切图谱特异基因表达受体：基因产物功能检测8菌落原位杂交理想的探针是筛选的决定因素基因产物功能检测依赖于筛选模型的建立，如酶的活性、抗生素抗性限制性酶切图谱

多次酶切筛选3.期望重组子的筛选9限制性酶切图谱10例如，已知某目的基因位于1.8kb的SalI片段中，将重组子用SalI切开，凝胶电泳分离，用刀片切下相当于1.6-2.0kb大小区域内的凝胶块，回收DNA片段，根据目的基因内部的特征性酶重复酶切过程直至筛选成功11通过亚克隆在已克隆的片段上准确定位目的基因，然后对目的基因进行序列分析，搜寻其编码序列以及可能存在的表达调控序列4.目的基因的定位12鸟枪法操作的改进-非随机鸟枪法前提条件：目的基因的酶切图谱已知目的基因两侧的酶切位点已知两个位点之间的距离已知如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体DNA，然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高重组子中目的重组子的出现频率13鸟枪法的局限性工作量较大，需要了解目的基因的背景知识；不能获得的最小长度的目的基因；不能除去真核生物目的基因的内含子结构14cDNA法

cDNAmRNA的互补DNA(complementaryDNA)反/逆转录病毒基因复制和表达中间产物分离mRNA体外合成cDNA克隆进入受体细胞筛选含有目的基因的重组克隆151.mRNA的分离纯化利用多数mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。mRNA只占总RNA的1%-2%。含有poly(A)的mRNA亲和层析低聚dT纤维素:用于poly(A)较长的mRNA多聚U琼脂糖:用于poly(A)较短的mRNA（<20A）无poly(A)的mRNA162.双链cDNA的体外合成反转录酶1）cDNA第一链合成逆转录酶以RNA为模板，OligodT（或随机引物）作引物，合成cDNA的第一链。mRNAcDNA3’5’5’AAAAAAATTTTTTTOligodT引物17cDNA单链的3’末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA。cDNA第一链5’cDNA第二链合成DNA聚合酶cDNA第一链cDNA第二链5’3’2）cDNA第二链合成-自身合成18核酸酶S1用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导致cDNA中有用的序列被切掉！）。cDNA第一链cDNA第二链5’3’cDNA第一链cDNA第二链5’3’5’3’19202）cDNA第二链合成-置换合成RNaseH识别mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，并将其降解成许多小片断小片断正好成为DNA聚合酶的引物，用来合成冈崎片断DNAPolI除去引物并修补后再使用DNA连接酶连成一整条DNA链21mRNAcDNA3’5’反转录酶引物mRNAcDNA第一链3’5’引物mRNAcDNA第一链3’5’mRNAmRNADNA聚合酶DNA聚合酶cDNA第二链cDNA第一链3’5’RNaseHDNAligase去引物2223第一链合成完毕后，变性去除残留的mRNA，在cDNA的游离3’末端添加OligodC，然后与人工合成的OligodG退火，形成引物结构，聚合第二条链。3）cDNA第二链合成-引物合成24mRNA3’5’AAAAAAAcDNA第一链5’TTTTTTTT3’碱处理cDNA第一链5’TTTTTTTT3’dCTP末端转移酶cDNA第一链5’TTTTTTTT3’CCCCCCC加入OligodG退火cDNA第一链5’TTTTTTTT3’CCCCCCCGGGGGGG5’3’聚合酶cDNA第二链cDNA第一链5’TTTTTTTT3’CCCCCCCGGGGGGG5’3’AAAAAAA25双链cDNA的克隆克隆方案的选择标准与鸟枪法相同末端性质筛选方案片段大小26cDNA重组克隆的筛选原位杂交产物功能检测差示法（差别杂交/扣除杂交）27在一个细胞群体中目的基因正常表达，在另一个细胞群体中目的基因不表达。在这种情况下便可制备到两种不同mRNA提取物。其一是含有一定比例的目的基因mRNA种的总mRNA群体，其二是不含有目的基因mRNA种的总mRNA群体。通过这两种总mRNA（或是它们的cDNA拷贝）为探针的平行杂交，对由表达目的的基因的细胞总mRNA构建的克隆库进行筛选。当使用存在目的基因的mRNA探针时，所有包含着重组体的菌落都呈阳性反应，在X光底片上呈现黑色斑点；而使用不存在目的基因的mRNA探针时，除了含有目的基因的菌落外，其余的所有菌落都呈阳性反应，在X光底片上呈现黑色斑点。比较这两种底片并对照原平板，便可以挑选出含目的基因的菌落。差别杂交2829局限性差别杂交的灵敏度比较低，特别是对于那些低丰度的mRNA而言，这个缺点就显得更加突出差别杂交需要筛选大量的杂交滤膜，鉴定大量的噬菌斑或克隆片段，十分耗费时间和金钱

30原理：羟基磷灰石柱结合DNA-RNA或DNA-DNA双链，不结合单链DNA。（Hydroxylapatitecolumn）扣除杂交31反/逆转录病毒基因复制和表达中间产物多聚U琼脂糖:用于poly(A)较短的mRNA（<20A）酸处理法，脱去与核苷酸1的5’-OH基团偶联的保护基团DMT。mRNA只占总RNA的1%-2%。一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目。载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。酸处理法，脱去与核苷酸1的5’-OH基团偶联的保护基团DMT。文库的质量标准（2）构建基因文库的载体选用优点：繁殖迅速，易于保存，克隆操作简 便，转化效率高N：所需的重组载体数（克隆数）结果是全保护的DNA：5’DMT,3’固相支持物,核苷酸之间对氯苯。从表达A蛋白和不表达A蛋白的组织细胞中分别提取和分离总mRNA。将表达A蛋白的mRNA合成cDNA第一链。再同不表达A蛋白的总mRNA杂交成cDNA-mRNA双链。不能杂交的cDNA就包括特异表达的A基因的cDNA单链。用羟磷灰石柱收集单链cDNA，合成为双链DNA进行扩增、克隆、测序。32AAA组织B组织总mRNA（A）总mRNA（B）含蛋白A的mRNA不含蛋白A的mRNA总cDNA第一链A杂交内含蛋白A的cDNA羟磷灰石柱过柱吸收RNA-DNA单链滤过羟磷灰石柱BA33PCR扩增法使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物。TheNationalCenterforBiotechnologyInformation/NCBI

::///genbankEuropeanBioinformaticsInstitute/EMBL-EBI:://ebi.ac.uk/DNADataBankofJapan/DDBJ:://ddbj.nig.ac.jp/index-e.html341.直接从基因组中扩增（1）提取基因组DNA作模板（2）根据目的基因序列设计引物（3）PCR扩增适合扩增原核生物基因。35原核基因组部分原核细胞提取基因组DNAPCR扩增36（1）提取基因组totalRNA（2）反转录合成总cDNA作模板（4）PCR扩增（3）根据目的基因序列设计引物2.从mRNA中扩增:RT-PCR适合扩增真核生物基因。37目的基因的引物1反转录成目的基因cDNA第一链目的基因的引物2目的基因cDNA第二链PCRmRNA38化学合成法1976年H.G.Khorana提出了用化学方法合成基因的设想，并于1979年在science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文。化学合成目的基因的前提：核苷酸序列已知目前通用的合成方法：固相磷酸三酯合成法39核苷酸1的3’-OH端在合成开始时就已经附着在惰性的固相载体上，同时它的脱氧核糖环的5’-OH基团也已用二甲氧基三苯甲基(DMT)保护起来。这种固相载体典型的情况是使用可控微孔玻璃(CPG)。40固相磷酸三酯合成过程结果是全保护的DNA：5’DMT,3’固相支持物,核苷酸之间对氯苯。最后脱保护。合成的一个循环周期分为如下步骤：第一步，脱三苯甲基作用(detritylation)酸处理法，脱去与核苷酸1的5’-OH基团偶联的保护基团DMT。在这种脱DMT反应中，常用的酸是二氯乙酸(DCA)或三氯乙酸(TCA)；42第二步，偶联反应(coupling)。通过一种弱碱——四唑(tetrazole)的催化反应，使加进来的第二个核苷酸(N2)同已附着在固相载体上的核苷酸1之暴露的5’-OH基缩合；43第三步，封端反应(capping)。由加入的乙酸酐(aceticanhydride)激发乙酰化作用，把所有的没有参与偶联反应的5’-OH基团全都封闭起来；44第四步，氧化作用(oxidation)。在核苷酸N1和N2之间新形成的3’-5’亚磷酸三酯键十分活跃。利用碘液催化作用，使之被氧化成为相当稳定的3’-5’磷酸三酯键。这也就是为何我们称这种寡核苷酸合成法为磷酸三酯法的原因。45化学合成寡聚核苷酸片段的能力一般局限于150～200bp，而绝大多基因的大小超过了这个范围，因此，需要将寡核苷酸适当连接组装成完整的基因46小片段黏接法预先设计合成12-15bp的片断，片段之间都有互补区域，不同片断之间的互补区域能形成有断点的完整双链。因此DNA片段在退火时可以自动排序，最后用T4连接酶连接即可得到完整基因。化学合成DNA片断的组装47T4DNA连接酶完整的DNA双链退火48优点：DNA片段小，回收效率高缺点：互补序列短，退火时容易错配49补丁延长法目的基因的一条链分成若干40-50bp的片段，另一条链设计成与上述大片段交错互补的小片段（约20bp）DNA片段在退火用Klenow将空缺处补齐，最后用T4连接酶修复缺口。50退火KlenowT4DNA连接酶51大片段酶促法预先设计的片断之间有局部互补区，可以相互作为另一个片断延长的引物，用DNA聚合酶延伸成完整的双链。523’5’5’3’5’3’T4DNA连接酶Klenow片段引物53将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。根据构建方法的不同，基因文库分为:基因组DNA文库（genomicDNAlibrary,含有全部基因）cDNA文库（complementaryDNAlibrary,含有全部蛋白质编码的结构基因）基因文库54

基因组文库的大小一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目。N=ln(1-p)ln(1-f)p:文库包含了整个基因组DNA的概率（99%）f:插入载体的DNA片断的平均长度占整个基因组DNA的百分数N：所需的重组载体数（克隆数）基因文库的完整性55例如：人的基因组是3×109bp，插入DNA片断的平均长度如果是1.7×104bpN=ln(1-p)ln(1-f)=ln(1-99%)ln(1-f)=4.61×GfN=4.61×GfG：Genome大小；f：fragment大小N=4.61×Gf=4.61×3×1091.7×104=8.1×10556cDNA文库的大小一个cDNA文库要包含99%的mRNA时所需要的克隆数目。p:文库包含了完整mRNA的概率（99%）:某一种低丰度mRNA占细胞整个mRNA的比例N：所需的重组载体数（克隆数）N=ln(1-p)ln(1-)1n1n57例如：人的成纤维细胞中，每个细胞内不到14个拷贝的低丰度mRNA约占整个mRNA含量的30%，这种mRNA大约11000种，因此1nn=11000/30%=37000=1/37000N=ln(1-0.99)ln(1-)137000=1.7×105包含完整人成纤维细胞cDNA信息的文库需要17万个克隆58

文库的质量标准1.重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力2.载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆3.克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆排序4.克隆片段易于从载体分子上完整卸下5.重组克隆能稳定保存、扩增、筛选59制备原则：DNA片段之间存在部分重叠、大小均一（1）染色体DNA大片