表面化学分析 生物传感功能化玻璃基底的表征 征求意见稿

1GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TR19693：2018表面化学分析生物传感功能化玻璃基底的表征本文件举例说明了ISOTC201范围内有助于表征生产生物传感装置基底性质的表面化学分析方法。成功的表征使人们有机会更好地了解生产过程中每个步骤的表面化学反应，这些特性将影响最终器件（如微阵列）的整体性能。制备的步骤包括连接分子固定用于基底活化，以及用生物传感（即所谓的探针）所需的特异性生物分子对活化的基底进行功能化修饰。其中，基于硅烷的玻片功能化是核心，这是后续固定探针分子的关键生产步骤。这些探针用于生物识别事件的传感。选择硅烷化工艺是目前生物传感器生产中最常用的工艺之一。本文件概述了识别基底、器件生产步骤（如清洁、活化和化学修饰）和有效期（如储存条件和老化）相关问题可能的来源方法、策略和指南。这些与表征玻璃基生物传感器的表面化学分析人员和生物传感装置生产领域的开发人员或质量管理者均特别相关。基于定量和定性表面化学分析，可以制定策略来确认器件制造中性能不佳的原因，并加以实施。本文件未讨论具体的处理方案。如需了解有关方案的更多信息，请参考专业文献，例如参考文献[1]至[9]。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ISO18115-1:2013表面化学分析词汇第1部分：通用术语及谱学术语（Surfacechemicalanalysis—Vocabulary—Part1:Generaltermsandusedinspectroscopy）ISO18115-2:2013表面化学分析词汇第1部分：扫描探针显微术术语（Surfacechemicalanalysis—Vocabulary—Part2:Termsusedinscanningprobemicroscopy）3术语和定义ISO18115-1:2013和ISO18115-2:2013给出的术语和定义适用于本文件。ISO和IEC维护的用于标准化的术语数据库网址如下：——ISO在线浏览平台：/obp——IECElectropedia：/4符号和缩写词AFM原子力显微镜APDMES3-氨丙基二甲基乙氧基硅烷2GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TR19693：2018APS3-氨丙基硅烷APTES3-氨丙基三乙氧基硅烷APTMS3-氨丙基三甲氧基硅烷FT-IR傅里叶变换红外光谱LEIS低能离子散射MEIS中能离子散射NEXAFS近边X射线精细结构吸收谱近边X射线吸收精细结构PCA主成分分析SCA表面化学分析SFG和频产生光谱术STM扫描隧道显微镜ToF-SIMS飞行时间二次离子质谱TXRF全反射X射线荧光光谱术WCA水接触角XPSX射线光电子能谱术5生物传感基底的表面化学分析表征5.1引言生物传感的概念是利用生物或生物分子识别事件转换成可测量信号（电、光、化学或热信号）。因此，在很多生物传感装置中，以固定在固相载体上的生物分子系统作为探针，从样品中捕获特定目标分子（分析物），发生生化反应，转化成可测量的信号[7][10-12]。微阵列是一种特殊类型的生物传感应用，用于生物反应过程的高通量分析，能够在极短的时间内实现对大量生物分子相互作用的定量和同步分析。典型的微阵列由生物分子探针组成，探针以单点形式排列，并微型化且空间分布明确的吸附在固体表面（见图1）。图1带子阵列的微阵列示例微阵列是生物化学、生物分析、医学或诊断研究中高通量筛选和检测的重要工具，尤其是在不断发展的组学领域（基因组学、蛋白质组学、糖组学和金属组学）中发挥着关键作用[13-15]。然而，目前仍需开发新的方法来解决与DNA和肽阵列的重复性、再现性和定量分析相关的问题，这就需要了解导致性能不可靠的相关因素。我们需要借助分析工具来理解阵列性能变异的来源并减少这种变异[16]。生物传感器可靠性和再现性的显著提高将有助于基于生物传感器的诊断设备在临床检验中的认可度。玻璃是用于生物传感器和微阵列制造中最常用的基底材料之一，因为它价格低廉、易于获取、稳定性高（对温度、多种化学物质和生物材料具有良好的耐受性）、荧光背景低、表面平整、非多孔性以及表面修饰的多种可能性。3GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TR19693：2018生物传感器制造中使用的大多数玻璃基底首先会涂覆一层功能性硅烷。然后，这些硅烷膜直接或者在活化后结合目标探针分子。因此，对清洁、预活化和硅烷化步骤进行严格的质量控制十分必要，尤其是为了识别污染物和适当表征所覆涂层[17-19]。本文件向生物芯片开发者和生产过程中的质量管理人员介绍了为人熟知的可用于控制玻璃基生物传感器生产每一步骤的表面化学分析方法。同样，本文件也适用于那些对基于玻璃的生物传感器进行表征有特定需求的表面化学分析家。通常采用的简单表面分析法，例如水接触角测量[20]，但其存在固有局限性，即只能给出分析表面的宏观概要信息。相比之下，采用基于表面分析技术的综合方法可以获得关于表面化学、种类和成分的详细信息，并且后来基于真空的表面表征技术组合也具有在识别制造和质量控制中的问题方面具有巨大潜力。5.2表面化学分析（SCA）技术5.2.1总则本条款简要概述了TC201中目前适用的表面表征技术，旨在为生物传感领域不熟悉这些方法的的用户提供信息。有关各项技术的详细信息，读者可以参考专业的教科书和其他文献[21][29]。5.2.2X射线光电子能谱（XPS）X射线光电子能谱（XPS）是一种强有力的表面化学分析工具，能够提供具体的元素信息和化学信息，同时对样品的要求限制很少。在XPS中，样品在超高真空（UHV）条件下被X射线照射。由于光电效应，表面会发射光电子。被检测到的光电子动能是发射原子（即组成元素）所特有的。除H和He外，可以对被检测表层进行定量元素分析。此外，还可以获取发射原子特定结合态的详细信息，因为发射光电子的结合能与其结合状态相关。在许多情况下，可以观察到特征化学位移。通过对高分辨率光谱的分析，可以发现被探测表面中元素结合态的定量信息。由于如今大多数实验室的XPS都使用了单色X射线，从而实现了高能量分辨率，因此通常可以区分样品中共存的化学物种。此外，还可以进行成像光电子能谱分析。在这种情况下，对比度可能来源于不同的元素分布，或者来源于某一元素高分辨率核心能谱的光谱组分的不同化学位移。使用最新仪器，可以达到约10μm的最终横向分辨率。XPS的典型灵敏度范围为0.1at%-1.0at%[30]。对于典型AlKαX射线源，信息深度约为10nm，具体取决于所用的光电发射信号[22][27]。由于现代XPS仪器配备有电荷中和器，因此可以对裸露的和经过功能化的玻璃载玻片进行分析，而无需对样品进行任何导电涂层处理。5.2.3飞行时间二次离子质谱术（ToF-SIMS）ToF-SIMS是一种采用飞行时间（ToF）质量分析器的二次离子质谱（SIMS）。SIMS是基于在超高真空（UHV）条件下用带有几千电子伏能量的一次离子束对样品进行轰击。在这个过程中，一次离子的能量通过原子碰撞传递到固体中，引发一系列碰撞级联反应。由于部分能量被反射回表面，原子、分子碎片、甚至完整的分子（质量高达10,000u）会从表面最外层被弹出，如果它们被电离，则可以被检测到。SIMS谱图中的碎片模式通常可以与被探测表面区域中存在的特定化合物相关联。对SIMS谱图中检测到的解吸二次离子质量的仔细分析，可以揭示被分析表面的元素和分子组成的细节。对于化学分析，SIMS在“静态模式”下运行，在此模式下，材料表面会以足够低的速率溅射，从而使原始表面在分析过程中不会受到明显损坏。如果使用聚焦的一次离子束，可以获得横向分辨率达到亚4GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TR19693：2018微米级别的分布图像。SIMS比XPS更具表面灵敏度，因为被检测的二次离子是从最外层表面（1-3个单分子层）发射出来的，对于某些选定的元素，可以达到ppm（百万分之一）级别的灵敏度。飞行时间质谱仪（ToF）具有高透射率和高灵敏度等特点，具有广泛的应用范围。它可以实现多种操作模式，包括表面光谱分析、成像和深度分析。由于现代的ToF-SIMS配备了电荷中和器，因此可以对裸露的和经过功能化的玻璃载玻片进行分析，而无需对样品进行任何导电涂层处理。ToF-SIMS实验通常会产生巨大的数据集。碎片化常常导致光谱中出现数百个峰。大多数情况下，单个峰的意义是未知的，但有时已知某些特征碎片模式，从而可以识别（准）分子峰。因此，采用数据降维方法，例如主成分分析（PCA来提取所有相关信息。PCA提供的得分图和载荷图有助于区分化学态、识别特征峰以及获取半定量信息[23-26]。5.2.4近边X射线吸收精细结构（NEXAFS）谱近边X射线吸收精细结构（NEXAFS）谱可提供补充XPS所需的化学状态信息，这些信息与表面上分子的化学结合和数量有关。在电子产额模式下，NEXAFS谱具有与XPS相同的信息深度。有机物中的饱和键和不饱和键很容易用NEXAFS谱来区分。同步加速器光是偏振光，角度分辨NEXAFS谱是一种工具，其能够以类似于红外光谱的方式，确定表面上分子或特定官能团的优先取向。在NEXAFS实验中，同步加速器光的能量在吸收边缘上逐步变化，例如在碳或氮的K边缘。通过这种方式，可以在X射线吸收谱中观察到从核心能级（例如C1s或N1s）到分子特定的未占据分子态（例如LUMO）的共振跃迁，其作为σ和π共振。这些谱特征使得NEXAFS谱成为一种在分子水平上表征样品的有效方法，但由于需要同步加速器源，不像XPS或ToF-SIM[28][29]那样的常规表面分析技术。5.2.5其他方法总则本文件主要关注XPS、SIMS和NEXAFS，但也有一些辅助技术常用于表征生物传感器应用的功能化玻璃基底。这些技术包括椭偏光谱、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、拉曼光谱、和频产生光谱（SFG）、全反射X射线荧光（TXRF）和水接触角（WCA），以上所列技术均为最相关的示例。其中一些技术对于本文件所涉领域而言不太为人所知，本子条款对其进行了详细解释。离子散射（LEIS和MEIS）[25][26][31][32]LEIS可提供有关固体样品最外层原子层原子组成的定量信息。在LEIS中，使用一束动能为几千eV的低能惰性气体离子检测表面。每个反向散射离子的能量均为对应碰撞对象的质量特征，这里的碰撞对象是表面原子。通过能量分析仪测量反向散射离子的能量，并可对表面进行元素分析。也可以检测从高达10nm的深度散射的离子，并产生能够表征相应元素特定深度成分的信号，并且还可以确定层厚度。由于LEIS散射机制仅包括可忽略的溅射，因此可以研究生物传感平台的化学性质，并且深度分布也并无破坏性。MEIS基本使用与LEIS相同的方法，但其使用能量约为100keV的离子。MEIS是一种能够以亚纳米深度分辨率检测膜成分的技术，该技术优先应用于微电子中使用的氧化物层。其可以很方便地用于裸基底研究，例如用于生物传感装置的玻片。到目前为止，文献中仅一个MEIS应用，该文献对有机金属膜进行研究[32]。光谱椭偏测量法5GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TR19693：2018如果对基底和覆盖层中材料的折射率有足够了解，椭偏测量法能够以亚纳米精度测量膜厚度的变化。对于玻璃上的有机膜，两种材料的折射率在可见光区非常相似，因此测量覆盖层厚度非常具有挑战性。在红外区域，有机膜具有与玻璃明显不同的光学性质，椭偏测量法在此显示出极其优异的潜力[26][28][33][35]。全反射X射线荧光TXRF利用极低角度X射线激发的裸露或功能化玻片的平坦表面，获得功能层中表面污染物和元素的浓度。使用全反射条件（X射线束的入射角通常小至0.05°),激发仅限于样品的最外层表面。通过使用软X射线范围内的单色同步加速器辐射和包括无窗探针在内的超高真空装置，甚至可以有效激发基底表面上碳或氮等轻元素。大量实验工作有助于对平面基底上的有机纳米层进行定量TXRF分析[36-41]。最近，经证实，通过可追踪的TXRF能够直接获得薄表面层中所选元素的单位面积质量。对于氨基硅烷功能化的硅晶片基底，测定氮的每单位面积质量，这可用于测定表面上氨基的数量。基于此对XPS进行校准，并通过XPS对氧化硅表面上的表面结合有机分子进行绝对可追溯的量化[42]。荧光光谱[43–45]、振动光谱（FT-IR和拉曼光谱）[25][26][28][46]、扫描探针显微镜（例如，AFM、STM）[25][26][28]和水接触角测量[28]等方法在本文件所涉领域中得到广泛使用，相关综述和教科书等参考资料也在本条中得到了引用。5.3微阵列玻璃基底的表征5.3.1玻璃表面组分玻璃基底的化学成分是影响整个生物传感实验的一项重要但又经常被忽视或忽略的因素。例如，使用钠和磷酸盐含量高的玻璃非常具有挑战性。已知磷酸盐和碱金属离子等非成键离子会催化Si-O键断裂并重新分布。此外，来自主体的污染物也倾向于分离到表面。因此，进行任何进一步加工之前，必须除去这些不需要的物质。可通过表面分析，识别物种并验证其是否成功移除[47]。接近地表区域的元素组成（在约10nm范围内）的玻璃样品可根据ISO18118:2015等标准，通过XPS进行测量。基于这些信息，可以区分钠钙玻璃、磷酸盐玻璃或硼硅酸盐玻璃等不同玻璃基底[48][49]。在BAM联邦材料研究和测试研究所，使用XPS比较来自不同供应商的用于微阵列应用的玻片表面组分。硅和氧是所有玻片的主要组分。对于由钠钙硅酸盐玻璃制成的玻片，其特征是含有大量钠、镁和钙。而在硼硅酸盐玻片中，硼是主要组分之一，钠含量很低。此外，所有玻片上均有发现少量铝、氮和钾。由浮法玻璃工艺制成的样品在一侧显示出锡特征峰。（详见附录A，表A.1）如North等人[49]所述，改变市售钠钙玻璃基底的玻璃配方可能会对生物传感器的性能产生显著影响，其观察到玻璃组分对抗体固定产生显著影响。使用水接触角测量（WCA）、荧光光谱和XPS对裸露玻片进行系统筛选后，用抗体固定效率表示的微阵列性能与单个化学组分有关，尤其是与镁含量的变化有关，而表面形态则用所用玻片的粗糙度进行表示（见图2）。XPS用于识别不同市售钠钙玻片玻璃表面中的元素差异。6GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TR19693：2018疏水疏水玻片A玻片A玻片A玻片B玻片B玻片B亲水注：接触角测量（顶层）、XPS（中间）、原子力显微镜（中层）和功镁）和玻片B（蓝色；低镁）的镁含量、表面粗糙度和生物固定功效之间存在显著相关[来源：经许可转载自“North，S.等人，生物接口设计的关键方面及其对生物传感器发展的影）：图2钠钙显微镜玻片的表面分析5.3.2清洁和预活化玻片的表征玻片清洁是生物传感器生产中的另一关键步骤，因为清洁的有效性决定反应性硅烷醇位点的数量，而后续步骤中固定硅烷连接分子又必须要用到这一位点。玻璃清洁程序的问题可能会导致诊断应用中的阵列性能发生变化。现已公布多种不同的玻璃基底清洁方案，其通常采用半导体行业中为人熟知的硅基底清洁方法[50-52]。但在这些方案中，很多方案的条件相当苛刻，其使用强酸和/或强碱、过氧化物或等离子体，因而这些方法因安全和废物处理法规的限制而难以整合到工业流程中。此外，这些清洁程序可能会改变玻璃的组分，尤其是其表面化学性质[53]。对于硅基底食人鱼洗液（piranha）处理，使用含水过氧化氢和硫酸混合物[47][51][54]通常就足以在涂覆硅烷涂层[54-56]之前清洁和活化表面，但目前已有更温和方案的相关报告，尤其是对于玻璃基底。其中一些内容的总结见表1。表1经研究证明有效的不同玻璃清洁可选方法123有关玻璃清洁程序和实用指南的更全面概述，请参见参考文献[18]、[19]、[47]和[54]。遗憾的是，目前尚无适合于所有目的的公认清洁和活化方法或试剂，但还是有少数已获认可的方法可以使用，尤其是对于玻璃表面[18][19][47][54]。所有方案均旨在创造一个表面上有大量硅烷醇官能团的清洁表面，7GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TR19693：2018这些官能团能够在接下来的硅烷化步骤中发生反应（见4.4）。通常，这种清洁和活化的硅基表面的表面密度约为每平方厘米5×1014个硅烷醇基团[57][59][60]。在每种情况下，均应通过表面化学分析，独立测试和验证玻璃清洁方案的效率。例如，SIMS可用于检测甚至定量硅烷醇基团和污染物，尤其是在（亚）单层体系中。附录A给出了一项详细研究，其在XPS、WCA和SIMS所采用的清洁方案的有效性方面，对市售的（预）清洁玻片进行调查。周围的碳氢化合物积聚是影响玻片上反应性硅烷醇基团数量的一种重要表面污染。Smith提出一种简单直接的方法来估算在实验室环境中处理的样品上碳氢化合物污染覆盖层的厚度。该方法以XPS测得的碳含量为基础[61]。5.4玻璃基底上功能化硅烷膜的表征几乎所有建立在玻片上的生物传感装置都是以使用表面硅烷醇基团（SiOH）作为反应位点的硅烷化反应作为其第一个生产步骤。已建立通过硅氧烷键连接到玻璃表面的覆盖层。对于通常带有胺等末端官能团的硅烷试剂，玻璃表面上存在的表面硅烷醇基团（SiOH）的数量和类型对其偶联至关重要。然而，这些硅烷醇基团的直接检测和定量目前仍是一项挑战。该问题的所有现有解决方案均为间接方法，并且依赖表面硅烷醇基团的不同标记策略以及随后使用XPS、SIMS、FT-IR、NMR、荧光或辐射测定法对标记进行检测[59][62][75]。氨基硅烷基膜现已使用多年，最近也进行了一些基础研究来探讨生物传感器所用的高质量且水解稳定的胺功能化单层的（可再现）形成[48][55][66][76–86]。已知有多种硅烷化方案用于不同类型的目的，有关更多细节，请参见参考文献[19]、[47]、[52]和[87-89]。市面上有各种不同类型的硅烷预涂覆玻片。纳米结构器件和生物传感器等特殊应用通常需要高功能密度单层。基本硅烷涂层的质量对生物传感装置的成品性能有很大的影响。对于可再现的器件性能，则必须要有涉及分子排序、取向和官能团可达性的高质量单层。通过XPS或ToF-SIMS对硅烷功能化的玻璃或氧化硅表面所进行的表面化学分析通常用于研究这种膜的化学组成、结构、质量和膜厚度。平坦支撑材料上的薄膜/覆盖层的厚度通常通过XPS进行测量[22][25][27]。Smith发表过关于在定量XPS[61]中对碳氢化合物污染层进行简单校正的研究。Cumpson提出过一种根据XPS数据确定膜厚度的非常简单的图解法[90]。对于颗粒和纤维等曲面上的薄膜，可对前文所提到的方法进行扩展[81-96]。由于使用ω功能化硅可能会大幅改变玻璃或二氧化硅表面的性质，因此对所有这些内容的概述已经超出本文件的范围。因此，在本子条款中，我们将重点关注氨基修饰表面的表面化学分析的一些选定示例，其中，该表面仍是用于生物分子固定的最常见平台之一。在最近一项研究中，Graf等人[55]提出一种经过优化的方案，即，通过使用已知文献数据对参数进行系统性修改，清洁基于硅片的微阵列并在其上涂覆氨基硅烷。对常用方案的XPS研究表明，HF清洁和固化等一些硅烷化前后步骤似乎多余。该研究的另一目的在于减少胺封端表面上共存的氮物种的数量，使其成为游离胺，即可用于进一步连接生物分子以制造生物传感器的主要物种。已成功使用XPS、ToF-SIMS和NEXAFS光谱分析最终膜的氮表面化学，并且还可开发用于硅上微阵列的可靠的氨基硅烷化方案。在经过优化的条件下，获得的游离胺成为表面的主要物质，其丰度超过90%，如图3a）所示[97]。峰拟合分析表明，可在N1sXPS光谱中区分质子化和非质子化（NH3+）胺。将同样市售的现成氨基硅烷修饰玻璃样品从原始包装中取出并直接用XPS进行分析，分析在这些表面生成范围很宽的不同共存氮物种（见图3b）和c））。酰胺等含氧物种（NHC=N1s光谱中的氧成分）的形成主要是空气暴露过程中的老化现象所致，可通过表面化学分析进行控制，并通过适当的样品储存和处理予以减少（详见4.5）。由于生物分子在后续生产步骤中的固定性能主要取决于反应性胺的量，因此N1sXPS是控制这一参数的重要工具。8GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TR19693：2018结合能（结合能（eV）a）新制备的氨基功能化硅片结合能（结合能（eV）b）来自新交付并启封的市售氨基玻片结合能（结合能（eV）c）来自新交付并启封的其他市售氨基玻片图3代表微阵列制造所用典型现场样品的N1s高分辨率XP谱图的对比采用详细表面化学分析的硅烷化方案的其他研究均已发表。Han等人[57]报告过关于在基于场效应晶体管（FET）的生物传感装置的氧化硅上采用不同活化/清洁方案，以及用3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）进行硅烷化的详细研究。通过结合使用WCA、FTIR、AFM、椭偏成像[35]和XPS，其发现通过MeOH/HCl（v/v，1/1）进行表面清洁和活化能够获得最佳结果，并且有必要使用稀无水乙酸进行硅烷化后的冲洗步骤，以获得厚度小于4nm的均匀硅烷层[57]。Metwalli等人[48]对使用三种不同的氨基硅烷浸涂的玻璃表面进行研究，这些氨基硅烷的化学链中有不同的氮原子（1-3），其浸涂旨在优化用于DNA微阵列实验的玻璃表面。氮含量和硅烷层厚度的相关性可以使用XPS和椭偏测量法予以确定。在AFM测量的支持下，发现APTES在1.5at%-2at%的氮原子分数下获得单层覆盖，分别对应于0.7nm-1.0nm的膜厚度[48]。角度分辨XPS数据揭示游离胺（NH2）远离玻璃表面的优先取向，质子化胺（NH3+）则因与界面硅烷醇基团的相互作用而朝向玻璃表面[48][49]。这些发现得到3-氨丙基三甲氧基硅烷（APTMS）膜的能量分辨N1sXPS光谱的支持[99]。图4示出了氨丙基硅烷单层的建议取向和结合情况。Kristensen等人[99]讨论过APTMS修饰硅表面的N1sXP光谱中的第三种组分，该成分为第一层硅烷的末端NH2基团与第二层硅烷醇基团相互作用产生氢键键合的胺基而形成，如图4h）所示[99][100]。所获得的1-2个硅烷单层的APTMS膜厚度证实这一点。对于黄金上胺封端的自组装单分子膜（SAMs发现由密度泛函理论计算支持的可比较的XPS信号[101][102]。此外还必须考虑XPS分析室UHV环境中分子取向的变化。9GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TR19693：2018）：图4根据参考文献[99]和[103]确定的氧化硅表面上结合3-氨丙基硅烷的可能性[104]最近一些研究表明，氨丙基硅烷（APS）基膜在水介质中容易发生硅氧烷键水解，从而导致表面胺官能团的显著损失[84、105]。由于APS部分的特殊分子结构和膜的3D结构，Si-O键可能很容易就会水解，但可通过使用长链氨基硅烷（即11氨基十一烷基三乙氧基硅烷）形成更稳定的单层，以用于可靠的生物传感应用，由此避免这一点[84]。或者，使用硅烷的气相沉积方案来更好地控制氨基硅烷单层的形成[47、56、83、86、106]。Dorvel等人开发过一种通过单官能硅烷进行单层沉积的程序，通过XPS、AFM和椭偏测量法测定，该程序生成0.8nm膜厚和6个氨基硅烷分子/nm²的高密度单层[106]。通过高分辨率N1sXP光谱，可以得出结论，大多数（97%）氮表面物种均为NH2部分，仅少数氮表面物种以质子化形式（NH3+）存在。经证实，通过这种方法形成的氨基硅烷层适用于多种生物传感平台，并在不同pH和高温下的不同水溶液中表现出优异的稳定性[106]。Shircliff等人[81]通过XPS研究过二氧化硅上用于DNA附着的3-氨丙基二甲基乙氧基硅烷（APDMES）单层。高分辨率Si2pXP光谱可以分解为103.0eV处的一个二氧化硅基底峰“SiO4”和101.1eV处的一个硅烷相关峰“SiO1”，从而可以量化APDMES的表面覆盖率。即使溶液中存在过量硅烷，但在不到100分钟的APDMES暴露后，APDMES表面覆盖似乎已达到饱和[81]。如图5所示，对于纯APDMES膜，研究者已经获得氮和硅烷特定硅原子含量之间的线性关系。此外，计算出的APDMES表面密度为4个硅烷分子/nm²,这与早期报告相当一致[59、107]。此外，研究者还研究过混合APDMES/丙基二甲基氯硅烷单层，并且由于氯硅烷和甲氧基硅烷有着不同的附着动力学，因此推荐优先采用分步沉积而非共沉积。以此方式，可以利用高分辨率Si2pXPS数据来控制混合膜中的APDMES分数。采用这种膜的DNA附着和杂交实验表明，随着混合单层中APDMES密度的下降，DNA探针荧光会有所下降，杂交效率则会有所提高[81]。结合能（结合能（eV）a）暴露于APDMES15秒后，二氧化硅上纯APDMES膜的Si2pXPS光谱GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TR19693：2018结合能（结合能（eV）b）暴露于APDMES480分钟后，二氧化硅上纯APDMES膜的Si2pXPS光谱时间（分钟）时间（分钟）c）[N]（正方形）和[Si]APDMES（菱形）对APDMES暴露时间的依赖性d）APDMES单层中的[Si]APDMES与[N][来源：经许可转载自“R.A.Shircliff、I.T.Martin、J.W.Pankow、J.Fennell、P.Stradi），图5通过XPS表征二氧化硅上的APDMES膜图5中绘制的%SiAPDMESvs%NXPS数据的线性拟合明显偏离因APDMS分子中Si和N的1:1化学计量而产生的预期单位斜率。这种偏离展示了使用XPS量化模型对从薄层获得的数据进行定量解释时所存在的问题，该XPS量化模型假设样品同质且各向同性，并且通常是在XPS量化软件中实现。对于此类理想样品，可以从使用峰值强度和列表相对灵敏度因子的测量光谱中获得其表面成分。但在分析薄层和膜时，必须考虑“XPS95%信息深度”z95%[108]，这是因为，对于膜厚度小于z95%的超薄膜，由于探测体积内样品化学深度的不均匀性，来自XPS的定量信息会有偏倚。为避免该偏倚，必须使用涉及表面分层结构的替代XPS量化模型（见参考文献[22]、[24]、[25]和[27]）。比较实验和模拟光电子能谱即可独立验证定量XPS数据的正确性[109-111]。动能Ekin相差很远的不同光电子峰之间z95%的显著变化是定量XPS分析中另一经常被忽略的问题。[63]作者所研究的ADPMES膜便是良好示例，其Si2p的Ekin约为1386eV，而N1s的Ekin则约为1086eV（见图5）。在样品均匀的情况下，可以容易校正，但在不均匀样品中（例如，在支撑材料上的薄有机膜中），元素分析就会出现显著的系统误差。“不均匀”在此意味着层厚度小于信息深度z95%。Girard-Lauriault等人试图缓解实验室XPS分析中这种不均匀层所固有的很多量化问题，其开发了一种GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TR19693：2018基于同步加速器的全新XPS分析策略，称为“恒定动能XPS”（CKE-XPS）[112]。该方法确保构成样品的不同元素具有恒定的z95%。此外，当使用同步加速器辐射源进行激发时，XPS信息深度z95%可以减少到小于1nm[112、113]。最后，我们回到North等人[49]发表的研究，请参见图2，该研究探讨了玻璃基底的化学成分对传感装置性能的影响。这些作者报告了玻璃成分的变化，该变化表现为表面镁原子分数的下降，并且还伴随着表面粗糙度和疏水性的显著下降。结果是，研究者认为这些现象是观察到的肽和蛋白质结合效率显著下降的原因。此处用于肽和蛋白质结合的附着3-巯基丙基硅烷连接层的性能与玻璃成分的变化有关。XPS用于确定硅烷化效率，其使用硫醇硅烷中的硫作为XPS鉴定的独特元素。5.5玻璃上氨基硅烷基生物传感平台的稳定性和有效期众所周知，氧化硅和玻璃表面的成分会随着环境条件的变化而变化[65、114-118]。用于生物分子附着的玻片和硅片顶部的有机涂层也会受到周围大气的影响。有效期数据对生物传感器平台非常重要，因为对于受监管的诊断应用，有必要验证给定时间段内的性能稳定性。下文所示是通过表面化学分析研究氨基硅烷涂层玻片有效期问题的示例。由于已经发现氨基官能团对老化敏感，因此胺功能化生物传感平台老化现象的系统研究也具有相关性[97、104、119]。已知老化会影响形态、润湿性和对生物分子的反应性等重要参数。与暴露于不同环境气体、压力和/或温度相关的老化过程研究是生物传感平台质量管理的一部分。市售氨基硅烷修饰玻片通过XPS进行检查，以通过比较以下样品，测试其稳定性：a）新交付并启封的样品；b）在-18℃环境空气中储存1年的样品；以及c）在-18℃环境空气中储存1年并在室温下再储存6个月的样品。对于长期储存试验，玻片保存在给定温度下原始供应商玻片盒内的环境空气中。图6示出了取自新鲜氨基玻片和储存在不同条件下的玻片的N1sXP光谱。对于在-18℃环境空气中储存6周（未显示）和1年的玻片，两者的光谱未显示出显著差异。相比于取自新启封的玻片，观察到结合能为400,6eV的酰胺（NH-C=O）成分有所增加，并且组分峰面积从17%上升至21%。研究者测量了由APTES制成的氨基硅烷膜的类似N1sXP光谱，该APTES取自在膜制备前几个月启封的样本瓶。这表明，在长期储存过程中，玻璃上的氨基硅烷基膜的老化现象与纯硅烷本身的老化现象相似[104]。玻片在-18℃环境空气中储存1年后，再在环境条件下储存6个月，N1s核心能谱的形状发生显著变化，光谱表明酰胺成分（NH-C=O，峰面积66%）是主要的表面氮物种（图6c））。膜中可能存在的APTES的未水解乙氧基团也将导致这种膜的整体老化。可通过SIMS进行控制。结合能（结合能（eV）a）从新启封的容器中取出的玻片（见图3）结合能（结合能（eV）GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TR19693：2018b）在-18℃环境空气中储存1年后的相同玻片结合能（eV）c）在室温环境空气中放置6个月后的相同玻片图6处于不同老化阶段的市售氨基硅烷涂层玻片样品使用具有主成分分析（PCA）功能的ToF-SIMS，并辅以XPS和NEXAFS谱，对二氧化硅基底上胺膜暴露于不同的环境气体、压力、温度和储存时间进行进一步老化研究[119]。该研究的重点是通过评价酰胺特有的谱特征来识别和量化老化。在结合能为400,3eV至400,7eV的N1s核心能谱中，酰胺类物种经XPS鉴定为NH-C=O组分峰（见图7），在光子能量为401eV的NK-edgeX射线吸收谱中，酰胺类物种经NEXAFS谱鉴定为τ*（NHC=O）共振[90、97、112]。GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TR19693：2018玻璃上的APTES，24周28周玻片A*28周结合能/eV玻璃上的APTES Si上的APTES玻片A*玻片A（c）来自新启封容器的玻片A上的市售APTES-SAM。（d）来自新启注：老化样品暴露在环境空气中数周。酰胺峰（HNC=O）出现在400.2eV-400.3eV之间。总体复合拟合与原始数据[来源：经SpringerScienceandBusinessMedia许可，转载自“GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TR19693：2018）：图7硅晶片和玻片上新鲜和老化APTES-SAM的N1sXPS在相应的ToF-SIMS中，酰胺类物种已经通过CNO等特定二级碎片离子（见图8）进行鉴定。此外，已发现使用PCA的多变量ToF-SIMS能够对胺表面老化以及模型和市售胺化玻片老化差异进行有效的半定量研究，并且该研究具有最高的灵敏度。通过这些研究得到的相关实际结论是：氨基硅烷基膜在-18℃氮气环境下储存时，胺向酰胺的转化可以在较长的时间内得到非常有效的抑制。这种样品储存方式是一种简单的预防措施，对于在生物传感器应用中用作基底的玻片，这样可以保持其胺端基表面的天然化学特性。老化时间老化时间/周a）CNO-二次离子产额（ToF-SIMS）老化时间老化时间/周b）N1sNHC=O组分峰的相对面积（XPS）[119][来源：经SpringerScienceandBusinessMedia许可，转载）：图8硅晶片上APTESSAM中酰胺形成与老化时间的关系5.6其他类型的功能化玻片另外两种具有封端官能团的玻片涂层在生物分子固定领域已经变得非常流行。这些涂层具有环氧或N-羟基丁二酰亚胺（NHS）酯端基。文献数据库搜索显示，相比于基于氨基硅烷化学品的涂层，使用XPS和/或ToF-SIMS对这些玻片涂层进行表面化学分析的研究数量（环氧树脂：100，NHS：60）要少得多（评分＞300）。使用XPS时，必须注意环氧树脂膜易受X射线诱导分解的影响，并且在通过XPS分析环氧功能化膜时必须特别小心。长时间暴露于X射线后，在C1s谱中观察到C-O/C-C成分面积比显著下降[120]。众所周知，含碳氧有机物（如聚合物）会在X射线下降解[121-123]。GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TR19693：2018使用这些玻片制作微阵列时，由于环氧基可以在开环下被水水解（例如在大气条件下（方案1因此必须考虑环氧基封端基底的老化问题。封端环氧化物转化为1,2-二醇部分，不再对胺或硫醇等亲核试剂具有反应性，因此阻碍玻璃表面所需的生物功能化。图9方案1：环氧硅烷修饰表面上的水解反应研究者进行有效期试验，以研究市售环氧硅烷和N-羟基丁二酰亚胺（NHS）酯聚合物涂层玻片的长期稳定性。已知NHS-酯基易水解生成羧酸[124-126]。通过XPS鉴定在新启封的玻片容器中储存后环氧硅烷玻片上相关表面物种的变化，储存条件为：a）在-18℃冰箱内的环境空气中储存1年；b）在-18℃冰箱内的环境空气中储存1年，然后再在封闭玻片容器中的环境条件下储存6个月，请参见图10。如图10所示，在-18℃冰箱中储存时，未观察到储存对环氧树脂玻片的核心能级C1sXPS产生显著影响。在-18℃空气中储存1年后，CC/CH和C-O主要成分的比率和元素组成（取自测量谱图，未显示）几乎无变化。在NHS-酯聚合物涂层玻片上，未检测到N-羟基丁二酰亚胺特异性成分，这是因为，主要CC/CH和C-O成分均来自三维聚合物涂层的主链。高分辨率C1s核心能级XPS显示，在-18℃下储存1年后，COOR组分峰面积增加（从0.4%增加到4.9%，请参见图10b），CC/CH组分峰面积减少。平行XP测量谱图显示，总碳含量和氮含量有所减少（均减少约50%），而与基底相关的硅和氧的含量则有所增加。（聚合物）材料的损失表明，对于这些玻片的应用聚合物涂层，与NHS酯水解相比，长期不稳定性似乎与损失关系更大。相比于在-18℃环境空气中储存1年，这种NHS聚合物涂层玻片的XP测量和核心能谱在环境条件下再储存6个月后仅发生微小变化。与此相反，对于环氧硅烷玻片涂层，在-18℃冰箱内的环境空气中储存1年再在环境条件下储存6个月后，观察到其表面化学性质发生显著变化。环氧树脂玻片C1s核心能谱中的CC/CH与C-O峰面积比显著增加至1.7，这是来自环境（实验室）空气的含碳污染物沉积所致。另一原因可能是间接阳光照射导致环氧硅烷膜发生额外分解（在长时间X射线照射后，C1sXP光谱以同样的方式发生变化[120]）。结合能（结合能（eV）a）来自新启封容器的市售环氧涂层玻片GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TR19693：2018结合能（结合能（eV）b）在-18℃冰箱内的环境空气中储存1年后的环氧树脂玻片结合能（eV结合能（eV）结合能（结合能（eV）c）环氧树脂玻片在-18℃冰箱内的环境空气中储存1年，然后再在环境条件下的空气中储存6个月结合能（结合能（eV）d）来自新启封容器的市售NHS-酯玻片结合能（结合能（eV）e）在-18℃冰箱内的环境空气中储存1年后的NHS-酯玻片结合能（结合能（eV）f）NHS-酯玻片在-18℃冰箱内的环境空气中储存1年，然后再在环境条件下的空气中储存6个月图10老化市售环氧树脂和NHS酯涂层玻片样品的XPS分析GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TR19693：2018除XPS外，环氧基团的水解还可以通过测试润湿性来间接监测，例如通过水接触角测量，如图11所示。对于新制备的环氧树脂玻片，测得的水接触角为53。[79、127、128]。在75%相对湿度下储存1小时因此，对于在大约40%-60%环境湿度下进行的典型微阵列实验，研究者认为这些环氧树脂玻片足够稳定，因而有助于获得恒定且可重复的实验结果。相比之下，环氧树脂修饰的玻片在浸入水中时会显著失活，这表现在水接触角的显著下降上，即1小时后降至36.2。，36小时后降至32.3。[见图11b）]。这种效应与所有在水或水性介质中利用环氧化物基固定化学性质的生物传感装置高度相关。 老化时间（小时）a）室温下，在相对湿度为75%的封闭湿度室中老化环氧树脂玻片老化时间（小时）老化时间（小时）b）环氧树脂玻片在水浴中的老化图11环氧树脂修饰玻片的水接触角数据6总结本文件表明，玻璃基底的表面组成、清洁度、润湿性、反应性和稳定性变化很大（取决于条件因此需要对基底的理化性质进行精确表征。已经给出很多最新的表面分析方法作为表征基于玻片和硅片的生物传感装置的示例。研究者发现XPS和TOF-SIMS十分有用，其能够获得定量化学信息（XPS）和分子信息（TOF-SIMS对痕量物质敏感，并对表面最上层的几纳米敏感。表2和表3给出了关于这些表面表征方法和更多相关方法的详细信息，以及可以获得的信息类型。在不久的将来，计量研究项目将选择特GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TR19693：2018定方面进行考量，而项目中的实验室间研究将用于测试全球不同实验室所建立的方案的可比性。需要解决的第一个问题是生物传感装置所用功能表面的元素和化学成分的定量测定。作为该文件的总结，表2概述了可从XPS、SIMS和NEXAFS获得的关于生物传感器开发、规范、生产期间的故障排除和质量管理的有用信息。表2XPS、SIMS和NEXAFS表征生物传感玻片表面的有用信息汇总（＜使用特定的电子产出模式时，约为10nm或更小另一项调查展示了与上述基于真空的表面化学分析方法互补的分析方法的主要应用，请参见表3。表3其他方法表征生物传感玻片表面的有用信息汇总GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TR19693：2018有些问题目前无法通过表面化学分析方法解决，这是本文件的主要关注点。最重要的一点是（1）缺少提供绝对定量数据的能力，例如玻璃表面上硅烷醇基团的量，或者，在下一步中，提供生物传感装置表面上胺、环氧和其他连接基团或探针分子的量。另一个相关要点则是（2）TC201涵盖的表面化学分析方法与生物传感领域通常使用的基于荧光的方法缺乏可比性。最后，还有一个高度相关的问题，即（3）探针和靶分子及其构象的定量只能在真空中通过基于真空的表面化学分析方法进行研究。生物传感器真实液-固界面的情况与其在真空中的分析情况之间存在差距。这一差距类似于使用基于真空的表面化学分析方法来解决催化中的问题时所谓的压力差距。一些活动可以解决上文所提到的第一个问题（1）。正在开发的方法可以给出用[官能团/nm²]表示的官能团数量，在不久的将来，可能会用这种方法以可追溯的方式校准XPS、SIMS或NEXAFS。这些方法是使用放射性标记[130]、标准游离X射线荧光光谱[131]和同位素稀释拉曼光谱[132]作为计数方法的主要方法。XPS、SIMS或NEXAFS应可通过经由这些方法认证的参考材料来提供利益相关方要求的绝对定量数据。第二点（2），XPS、SIMS或NEXAFS所生成数据与荧光方法所生成数据的可比性也在考虑之中。这里的主要问题是各种方法之间的灵敏度范围存在重叠。已对通过XPS和荧光光谱获得的数据的相关性进行了原理论证[133、134]。此处携带两个标记组的特定分子已成功投入使用，其中一个标记用于XPS、CF3物种，另一荧光团则用于荧光光谱[134]。最后一个问题（3）最具挑战性。但目前已开发出具有薄X射线透明窗口的液体池，该液体池储存在真空容器中，使得诸如XRF和NEXAFS等X射线技术能够投入运行。因此有可能在这种X射线窗口的内表面设计生物传感模型装置。通过这些操作即可在将来开展关于液相中探针分子构象和原位探针靶相互作用的研究。GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TR19693：2018预清洁市售玻片的研究所有市售玻片的制造商或供应商均提供用于生物传感或微阵列应用的（预）清洁玻片。但除在网站上公布的一些数据外，很少有人知道具体采用哪种清洁方案，或者在清洁之后达到哪些规范要求（例如，WCA、碳污染）。通过进行XPS和ToF-SIMS等表面化学分析，可以获得关于这些玻片的元素组成以及有机表面污染物化学性质的信息，而与相关化合物的光谱库、标准操作程序（SOP）和/或主成分分析（PCA）结合使用时，该流程可实现自动化。此外，常规的水接触角（WCA）测量也有用，但其应以XPS和SIMS数据为基础。在BAM进行的一项研究旨在研究碳污染的性质以及制造商已清洁市售玻片的清洁度，结果显示表面污染的类型和数量存在显著差异。在研究过程中，研究者通过XPS和ToF-SIMS分析来自不同供应商的两件未清洁玻片（1-2）和九件已清洁玻片（3-11）。首先测量XPS测量光谱，以获得所研究玻片表面层中的元素组成信息。这些结果已在表A.1中总结，这也证明XPS具有区分不同玻璃基底的能力[48、49]。除硅和氧等主要玻璃成分外，在钠钙硅酸盐玻璃中还发现大量的钠、镁和钙，而硼则是硼硅酸盐玻璃的主要成分。样品2和11由浮法玻璃制成；这些玻片在一侧显示出Sn特征峰（见表A.1）。此外还测试了名义上与样品6相同但实际来自三个不同批次（样品6-1、6-2和6-3）的玻片的批次间差异。子研究发现碳的平均表面含量为（2.5±0.4）at%。发现表面C和O原子分数测量的最高标准不确定度为±0.8at%。这只是峰强度测量中的统计不确定度。关于不确定度，还有其他未阐明的来源，例如将计入测量综合不确定度的系统误差。研究者发现，表明不同清洁度水平的表面碳含量是所分析玻片相关度最高的差异。该研究揭示了用碳表面原子分数[C]表示的碳质污染物，其含量约为2at%-10at%（见表A.1）。不同供应商提供的“清洁”钠钙硅酸盐玻片展示了碳表面原子分数的广泛分布。玻片3、8和9的[C]非常接近，约为5at%，但在玻片4、10和11上检测到数值则要高得多，三者的[C]均大于8at%。比较来自同一供应商的未清洁（1-2）和已清洁（5-7）硼硅酸盐玻片，发现清洁后碳表面原子总分数[C]减少50%以上（见表A.1）。由此证实供应商特定清洁方案的效率（使用具有不同pH值的多个清洁步骤、冲洗步骤和最终干燥阶段的自动超声波清洁线）。文献中报告的其他已清洁钠钙玻璃和硼浮法玻璃的碳表面总原子分数较为接近，其数值均在2at%-4at%之间[48]。表A.1通过XPS、有机碳污染厚度（dorg.C）b和测得的分析玻片水接触角（WCA）a来衡量的表面元素组成样品IDO（at%）Si（at%）C（at%）Na（at%）B（at%）Ca（at%）Mg（at%）Sn（at%）dorg.C（nm）未清洁玻片64.8±0.824.7±0.45.7±0.80.4±0.13.1±0.4ccc0.246.4±2.062.5±0.823.3±0.27.3±0.90.5±0.02.8±0.3cc1.3±0.10.349.0±2.5已清洁玻片63.2±1.123.4±0.35.3±1.44.8±0.2c1.4±0.01.1±0.1c0.217.8±2.160.7±1.122.9±0.38.6±1.44.4±0.2c1.3±0.01.2±0.1c0.4d65.8±0.926.5±0.22.4±0.80.3±0.13.6±0.3ccc0.125.9±1.166.1±0.826.3±0.32.6±0.80.5±0.23.5±0.3ccc0.121.9±1.467.0±0.425.7±0.12.5±0.50.5±0.13.4±0.3ccc0.121.3±0.863.8±0.524.2±0.15.5±0.52.8±0.0c1.4±0.01.2±0.1c0.2d64.3±0.424.0±0.44.6±0.43.6±0.1c1.4±0.11.1±0.1c0.2d60.2±0.323.5±0.19.8±0.42.8±0.2c1.6±0.11.2±0.1c0.4e56.6±0.821.5±0.413.1±1.03.1±0.1c1.4±0.12.1±0.11.3±0.00.6e批次间差异6-166.1±0.826.3±0.32.6±0.80.5±0.23.5±0.3ccc0.1f6-268.1±0.225.0±0.22.1±0.30.4±0.03.3±0.2ccc0.1fGB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TR19693：20186-367.4±0.324.9±0.42.8±0.20.5±0.03.4±0.4—c—c—c0.1f不定碳层厚度是表征玻片上污染水平的另一参数。为根据玻璃上超薄层的厚度来量化碳污染，研究者进行了XPS光谱模拟。将表面存在的不定碳物种模拟为类似聚合物的污染物[136、137]，其平均化学成分是通过高分辨率的C1sXPS光谱来测定。对实验和模拟C1s/Si2p强度比进行比较，发现污染层厚度清洁后：0.1nm）[136]。相比于水接触角分析（WCA发现XPS能够提供更为具体的信息，前者经常用于生物传感器生产中的质量控制和故障排除。如表A.1和图A.1所示，通过将接触角从约50°降至25°及以下，可以清楚区分未清洁与已清洁的玻片。但对于来自不同供应商的已清洁玻片，接触角与碳表面含量之间没有明确的相关性。对于同一供应商，可能会发现两者之间的相关性。通过主成分分析（PCA）分析数据时，ToF-SIMS能够区分来自不同供应商的玻片。关于有机表面污染物化学性质的详细信息已通过使用峰列表的正ToF-SIMS质谱的PCA获得，分析排除源自主要玻璃成分（H+、Na+、Al+、K+、B+）和硅相关碎片峰（例如Si+、SiH+、SiOH+）的高丰度二次离子。XPS和ToF-SIMS以及随后的PCA是进行玻片清洁度特定控制的有用方法。使用ToF-SIMS数据的PCA和高分辨率XPS鉴定相关的表面污染物。玻片清洁度可以用XPS表面碳原子分数或污染层厚度来表示，后者是根据测得的C1s/Si2pXPS强度比得出。显然，正如通常所假设的情况，已清洁玻片的WCA与通过碳表面含量或碳质污染层厚度等参数表示的表面污染并无直接关系。未清洁未清洁已清洁表面碳浓度[at%]注：表面成分见表A.1。如方框所示，除玻片3外，其余所有玻片均来自同一供应商。图A.1选定玻片样品的水接触角与XPS碳表面原子分数的关系GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TR19693：2018参考文献[1]SobekJ.etal.,QualityConsiderationsandSelectionofSurfaceChemistryforGlass-BasedDNA,Peptide,Antibody,Carbohydrate,andSmallMoleculeMicroarrays,Microarrays,WalkerJ.M.(Ed.)2007,HumanaPress.p.17-31[2]SobekJ.etal.,OptimizationWorkflowfortheProcessingofHighQualityGlass-BasedMicroarrays,Microarrays,WalkerJ.M.(Ed.)2007,HumanaPress.p.33-51[3]SobekJ.etal.,ProcessingProtocolsforHighQualityGlass-BasedMicroarrays,Microarrays,WalkerJ.M.(Ed.)2007,HumanaPress.p.53-66[4]TurnerA.P.F.Biosensors:senseandsensibility.ChemicalSocietyReviews,2013.42[5]TrillingA.K.,BeekwilderJ.,ZuilhofH.Antibodyorientationonbiosensorsurfaces:aminireview.Analyst,2013.138(6):p.1619-1627[6]SadanaA.,&SadanaN.HandbookofBiosensorsandBiosensorKinetics2011,Elsevier[7]NorthS.etal.,Criticalaspectsofbiointerfacedesignandtheir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