基因工程的基本操作程序（第二课时）高二生物课件（人教版2019选择性必修3）

基因工程重组DNA技术的基本工具基因工程的基本操作程序基因工程的应用蛋白质工程的原理和应用第2节基因工程的基本操作程序第2课时赵全华目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定前提核心关键保证基因工程的基本操作程序（四步）

获取了足够量的Bt基因后，下一步就是要让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；同时，使Bt基因能够表达和发挥作用这就是需要构建基因表达载体。这也是培育转基因抗虫棉的核心工作那么基因表达载体是由哪些部分组成的呢？目的基因启动子终止子标记基因抗生素抗性基因）表达特定性状位于基因的首端,是RNA聚合酶结合位点，基因转录的开始位于基因的末端,终止转录检测目的基因是否导入受体细胞复制原点：DNA聚合酶结合位点二、基因表达载体的构建（核心）①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键。③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少。④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。注意思考1.表达载体为什么一定要有启动子？（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能有利于基因的表达；（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体细胞无法转录。终止子终止子是位于基因尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录标记基因鉴别受体细胞中是否含有目的基因，筛选含有目的基因的受体细胞。如抗生素抗性基因，荧光蛋白基因等启动子操纵基因结构基因

启动子RNA聚合酶

一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游（首端），紧挨转录的起始位点是RNA聚合酶的识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。基因表达载体的构建过程1.用一定的限制酶切割载体，使其出现一个切口，露出黏性末端.2.用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。3.将切下的目的基因片段拼接到载体的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子。用DNA连接酶处理后会出现几种产物？

思考单酶切(a酶）的缺点①质粒重新环化②质粒与目的基因反向连接③目的基因自身环化④产生质粒与质粒的连接产物以及目的基因与目的基因的连接产物。双酶切(a酶和b酶）的优点①防止DNA连接酶连接时，使质粒重新环化②防止DNA连接酶连接时，质粒与目的基因反向连接③防止DNA连接酶连接时，使目的基因自身环化④避免质粒与质粒以及目的基因与目的基因的自身大量连接（1)设计引物的依据是：（2)引物设计时既要考虑目的基因序列，又要考虑载体序列，原因是：（3)使用的一对引物的序列相同吗？

目的基因两端的核苷酸序列为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的5’端加上限制酶的酶切位点不相同，目的基因两端具有不同的核苷酸序列注意：两种引物才能确保DNA的两条链同时被扩增拓展：引物（4)引物设计的要求（或引物失效的原因）

a._______________________________________b._______________________________________（5)每种引物内部不能发生局部碱基互补配对的原因

______________________________（6)两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对的原因

_______________________________________________（7)两种引物都结合在DNA模板链的_____端脱氧核苷酸连接在引物的_____端进行延伸每种引物内部不能发生局部碱基互补配对两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对防止引物自身折叠3’防止引物之间配对，导致引物不能同模板链结合3’若想获得以下已知序列的DNA片段，设计了一些PCR引物，应选用的PCR引物是______(从引物①②③④中选)DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)已知序列PCR引物①5′AACTATGCGCTCATGA3′②5′GCAATGCGTAGCCTCT3′③5′AGAGGCTACGCATTGC3′④5′TCATGAGCGCATAGTT3′③①

思考若如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，若想获得未知序列，选用的PCR引物应是______②④方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法（最多）花粉管通道法——显微注射法——感受态细胞三、将目的基因导入受体细胞将目的基因导入植物细胞第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌；第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。

两次拼接：两次导入：花粉管通道法在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。（1）方法：显微注射法提纯含目的基因表达载体受精卵显微注射移植到输卵管或子宫受精卵发育新性状动物（2）操作:显微注射技术将目的基因导入动物细胞常用法：常用菌：微生物作受体细胞原因：Ca2+处理法（感受态细胞法）受体细胞：Ca2+感受态细胞吸收将目的基因导入微生物细胞大肠杆菌原核细胞繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少总结生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法;花粉管通道法显微注射法Ca2＋处理法(感受态细胞法)受体细胞体细胞受精卵原核细胞目的基因进入受体细胞后，一定稳定维持和表达其遗传特性吗，怎么判断？思考检测鉴定③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等②检测目的基因是否转录出了mRNA①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因四、目的基因的检测与鉴定1、检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因①首先取出转基因生物的基因组DNA；（1）方法:DNA分子杂交（2）过程:②将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针；③使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明目的基因已插入染色体DNA中。15N15N变性变性检测DNA变性、复性与分子杂交2、检测目的基因是否转录出了mRNA①方法:分子杂交②过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,

表明目的基因转录出了mRNA。3、检测目的基因是否翻