DB1302T 353-2013 平菇原生质体脱毒技术规程

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DB1302唐 山 市 地 方 标 准DB1302/T353—2013平菇原生质体脱毒技术规程2013-07-01发布 2013-08-01实施唐山市质量技术监督局发布DB1302/T349—2013DB1302/T349—2013II前 言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由唐山市质量技术监督局提出。本标准起草单位：唐山师范学院。本标准主要起草人：范永山、张运峰、张淑红、李小六。DB1302/T349—2013DB1302/T349—2013PAGEPAGE1平菇原生质体脱毒技术规程范围本标准规定了平菇原生质体脱毒的实验室准备、原生质体制备、原生质体再生、鉴定。本标准适用于平菇菌种的原生质体脱毒。规范性引用文件GB/T6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法GB/T12728-2006 食用菌术语GB19172-2003 平菇菌种GB/T27405-2008 NY/T528-2010 食用菌菌种生产技术规程NY/T1743-2009 食用菌菌种真实性鉴定RAPD法NY/T1845-2010 食用菌菌种区别性鉴定 拮抗反JJG552-1988 血细胞计数板试行检定规程DB1302/T306-2011无公害平菇栽培技术规范术语和定义GB/T12728-2006中确定的及下列术语和定义适用于本文件。平菇指层菌纲伞菌目侧耳科侧耳属的主要品种。初始菌株保存于PDA斜面或其它适合培养基内的平菇带毒菌株。平菇病毒病病原和症状见附录A。原生质体脱去细胞壁的植物、真菌或细菌细胞。稳渗剂用于维持原生质体形状和功能的渗透压稳定剂。再生菌株指原生质体经过培养获得的单菌落。脱毒菌株经过栽培试验，无病毒感染症状的优良再生菌株。实验室准备实验室要求实验室质量控制规范应符合GB/T27405-2008的规定。仪器和设备超净工作台：无菌风的纯度≤0.5/皿•时(φ90mm121℃。25℃～50℃。10℃～500～200rpm。400试剂应使用分析纯试剂，水为GB/T6682-2008规定的水。稳渗剂0.6moL（pH7.012120n。细胞壁降解酶walme。培养基PD称取土豆200g，切片（厚度3mm～5mm）后置于1L沸水中煮20min，然后用三层纱布过滤，向滤液中加入葡萄糖20g，定容至1L。在高压蒸汽灭菌器中121℃灭菌20min。PDA在1LPD液体培养基中加入琼脂粉15g15mn12℃灭菌20in。PSA称取土豆200g，切片（厚度3mm～5mm）后置于1L稳渗剂中煮20min，然后用三层纱布过滤，201L15g15min12120min。原生质体制备菌丝体活化在超净工作台中用接种针挑取少许初始菌株的菌丝，接种于PDA平板表面，25℃培养5d～7d。摇瓶培养3～550mLPD培养基的摇瓶中，25℃、180rpm5d。破碎菌丝体PD培养基中挑取菌丝球置于重量为G1的1.5mL10000rpm5minG2G=G1-G2（G=0.1g左右。用玻璃棒（6mm）将菌丝球捣碎。酶解0.02g1mL0.22μm（现配现用352.5h30min颠倒混匀一次。原生质体分离利用300目细胞筛过滤酶解产物，获得含有原生质体的滤液。原生质体观察和计数利用光学显微镜观察原生质体。按照JJG552-1988的要求进行原生质体计数。原生质体再生1.0×105个0.5mL/皿均匀涂PSA再生培养基上，25℃静置培养，直到平板上长出菌落。PDA鉴定再生菌株的真实性鉴定拮抗反应鉴定PDANY/T1845-2010的要求进行拮抗反应试验。选择无拮抗反应的再生菌株进行遗传学鉴定。遗传学鉴定NY/T1743-2009RAPD指纹图谱的再生菌株进行以下鉴定。脱毒菌株的鉴定按照DB1302/T306-2011进行出菇试验，观察无病毒感染症状，获得脱毒菌株。按照NY/T528-2010进行菌种生产，脱毒菌种应符合GB19172-2003的规定。附录A(资料性附录)平菇病毒病病原和症状病原糙皮侧耳球形病毒（oystermushroomsphericalvirus，OMSV）糙皮侧耳等面体病毒（oystermushroomisometricvirus，OMIV）糙皮侧耳病毒-I（Pleurotusostreatusvirus-I，POV-I）糙皮侧耳病毒-SN（Pleurotusostreatusvirus-SN，POV-SN）症状菌丝体感染病毒后多表现于生长速度变缓，菌落边缘不整齐。子实体感染病毒后常见以下症状：菌盖边缘呈波