DB35∕T 1822-2019 水禽圆环病毒感染PCR鉴别诊断技术

DB35DB35/T1822—2019水禽圆环病毒感染PCR鉴别诊断技术PCRdiagnostictechniquesfordifferentiatingcircovirusinfectioninwaterfowls2019-04-18发布2019-07-18实施福建省市场监督管理局发布I 1 1 1 4 6 7本标准主要起草人：傅光华、施少华、黄勇、彭春香、傅秋玲、黄瑜、白泉阳、叶洪、万春和、1水禽圆环病毒（Waterfowlcircovirus）为圆环病毒科圆环病毒属的成员，主要包括鸭圆环病毒），）：2发病鸭（鹅）的法氏囊、脾脏等器官，剪碎后与磷酸盐缓冲液（PBS，见附录A的A.8）按体积比1：5的比例制成组织匀浆液，反复冻融3次，8000r/min离心30min，取上清，用于DNA抽提，或置-20℃冻若采集的样品需放置6h以上再进行处理，应先置-20℃条件下保存备用，需托运时应确保冷藏或其中，CVF为共用上游引物，CVF与DuCVR用于检测DuCV，扩增条带为554bp大小的基因片段，CVF与GoCVR用于检测GoCV，扩增条带为407bp大小的基因片段。各引物的工作浓度均为10mmol/L，保存于4℃~8℃条件下。3），反应结束后，分别取待检样品、阴性对照样品、阳性对照样品和空白对照样品各5μLPCR产物使用凝胶成像分析系统观察核酸条带并判断结果，经核酸扩鸭圆环病毒样品出现554bp大小的扩增条带（参见附录C中图C.1的3号泳道阳性样品混合物出现407bp和554bp大小的扩增条带（参见附录C中图C.1的4号泳道），空白对照样品和阴性对照样品均无），4A.23mol/L的醋酸钠溶液(NaOA.5.1配制0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液（称取二水乙二铵四乙酸二钠18.61g溶解于适量灭菌去离子水中，混匀后用10%氢氧化钠溶液调pH羟基甲基氨基甲烷（Tris）242g0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（pH8.0）50×TAE电泳缓冲液5置微波炉中加热至完全融化，待冷至50℃~60℃时，加溴化乙锭（EB）溶液5µL，摇匀后倒入制Na2HPO4·12H2OKH2PO4将上述试剂溶于800mL蒸馏水中，定容至1000mL，1.034×105Pa高压灭菌30min，4℃保存备6 AATCTCGCGGGAAGTGGTGGGATGGCTATAATGGGCAGGATGTGGTTGTGATGGATGATTTTTATGGGTGGCTCCCTTCCTTTTAAGGATCTGTGATCGCTATCCTTTACGGGTTGAGTATAAGGGTGGTATGACCCAGTTCGTGTCTAAGACCCCTAATAGGGAGCCTCGCGATTGGTATAAATGCGAGTGTGATGTGTCGGCATTGTATCGGAGAATTAATCAGTACCTGGATGGTTATGCGCCCGCCCCTGATTTTATGCTGCCGTTCCCAATAAACTACTAGAGACCTGGTTAAGGTTAGAATAAGTGTAAAATTACAATAAAGTTATGGTGCAAGCCCAGTCCATTGTCAACCACGCGGGAAGTGGTGGGACGGTTACTCGGGAAATGACGTAGTCGTCATGGACGACTTTTATGGTTGGTTGCCTTTTTGCTGAGAATTACCGACCGTTACCCTTTACGGGTTGAATTTAAAGGCGGTATGACTCAGTTTGTGGCTAAGACCTTGATGTAACCGCGAGCCTCGTGATTGGTACAAGAGCGAGTTTGACCTTTCAGCTCTGTACCGCAGAATTAACAAGTATCTTGTGTGACAAGTACGAACCCGCCCAGGCATGTACCCTCCCGTTCCCAATAAACTACTGAGACCAATTTGCCGTGAGTCGTTTATTAACTTGGCAGGGTATTACACTTGGGCAGCTCGGTTAAGGTTAGGCACTTGGCAGGGATTAAACACTTGGGCAGCTCGGTTAAACTTGGCAGGGATT