DB36T-动物源性食品中金刚烷胺的检测 量子点微球荧光免疫层析法编制说明

1--1-江西省地方性指导意见动物源性食品中金刚烷胺的检测量子点微球荧光免疫层析法（征求意见稿）编制说明标准起草组2022年10月《动物源性食品中金刚烷胺的检测量子点微球荧光免疫层析法》编制说明1.工作简况（包括任务来源、协作单位、主要工作过程、标准主要起草人及其所做的工作等）1.1任务来源根据《江西省市场监管局关于下达2022年第一批江西省地方标准化指导性技术文件制修订计划的通知》的要求，由南昌大学负责《动物源性食品中金刚烷胺的检测量子点微球荧光免疫层析法》起草工作。起草单位成立标准起草组进行本标准制定的各项工作。项目计划编号：DB36/Z-2022-01。1.2目的及意义金刚烷胺(amantadine，AMD)是一种抑制流感病毒的抗病毒药物，其分子式为C10H17N，结构如图1所示，相对分子质量为151，易溶于有机溶剂，微溶于水，无嗅无味。图1金刚烷胺结构式金刚烷胺具有良好的抗病毒能力，曾经大量用于预防和治疗猪传染性胃肠炎和禽流感。近年来的研究表明，A型流感病毒对金刚烷胺的耐药性逐渐凸显。卢桂兰等分析了2008～2011年连续3个流感监测季80株儿童甲型H3N2流感毒株金刚烷胺类耐药情况，结果显示甲型H3N2流感毒株耐药率分别为88％、100％和100％。周妍等对2009～2012年上海地区儿童甲型H3N2流感病毒的耐药性进行监测，结果表明，测序的病毒株对金刚烷胺耐药率达到100%。长期滥用金刚烷胺将会提高流感病毒株的耐药性，进而危害人类健康。2005年农业部发布第560号公告，金刚烷胺类等人用抗病毒药移植兽用缺乏科学规范、安全有效的实验数据，用于动物病毒性疫病不但给动物疫病控制带来不良后果，而且影响国家动物疫病防控政策的实施，因此禁止金刚烷胺在畜禽养殖业中的销售和流通。然而，近年来食品中金刚烷胺检出事件仍时有发生。长沙河马市集商贸有限公司销售的农家鸡、湖南牧胜飞农副产品贸易有限公司生产的农家鸡蛋、重庆明品福冷链物流公司的冻鸡大腿、拉萨堆龙德盛普惠农业科技发展有限公司销售的公鸡和山东的粉壳鸡蛋均被检出含有禁用药物金刚烷胺。杨琳芬等随机检测了606批次禽蛋和278批次禽肉，检出3批金刚烷胺阳性样品。齐刚等对12批鸡蛋样品进行了检测，检出2批金刚烷胺阳性样品。程静等2017～2018年在内蒙古地区采集鸡蛋60份、鸡肉60份，金刚烷胺的检出率达22.5%。由此可见，目前食品中金刚烷胺仍在非法使用，需要严格管控。为了更有效地监管金刚烷胺，保障食品安全，近年来我国制定了食品中金刚烷胺检测的国家标准、行业标准和地方标准（见表1）。表1食品中金刚烷胺检测的国家标准、行业标准和地方标准标准类型及标准号检测方法实施时间食品基质方法检测限国家标准GB31660.5-2019液相色谱-串联质谱法2020.04.01猪、鸡和鸭的可食性组织及禽蛋1.0µg/kg出入境检验检疫行业标准SNT4253-2015液相色谱-质谱/质谱法2016.01.01鸡肉、鸡肉制品、猪肉、肝脏、鱼、虾、蛋、皮蛋1.0µg/kg江苏省地方标准D832/T1163-2007液相色谱-串联质谱法2008.01.26鸡肝2.0µg/kg山东省地方标准DB37/T3762-2019液相色谱-串联质谱法2016.08.29鸡肉1.0µg/kg河北省地方标准DB13/T5145-2019酶联免疫吸附法2020.01.28鸡肉、鸭肉0.85µg/kg检测金刚烷胺的残留可采用传统的仪器检测方法，主要有液相色谱法、气相色谱法、液相色谱－串联质谱法、超高液相色谱－串联质谱法等。然而，传统的仪器检测方法不仅需要昂贵的仪器设备、复杂的样品前处理过程，还需要专业的技术人员进行操作，这些不利因素使这些检测方法不适用于现场检测。而食品安全快速检测技术具有简便、快速、廉价、对人员要求低、现场结果可视化等优点，基本满足基层监管的需求。截止到目前，原国家食药总局和现国家市场监管总局发布了多项食品快速检测方法，并且持续制定各种政策法规，大力推动食品快速检测方法的应用实施。量子点微球（Quantumdotsmicrospheres，QM）是将量子点包裹进纳米级聚苯乙烯微球中制备出的新型量子点标记材料，是一种性能优异的生物标记材料。通过将单独的量子点包埋到其它微球内以获得更好的化学和胶体稳定性，同时由于量子点的聚集而获得更强荧光强度，提高量子产率，并且可以解决单一的量子点水溶性差、尺寸较小不易与标记抗原或抗体分离的缺点。量子点微球荧光免疫层析技术（Quantumdotsmicrospheresfluoroimmunoassay,QMFIA）是一种新型的免疫荧光标记技术，利用免疫学高特异性和量子点微球强荧光特性相结合建立的一种高灵敏度的快速检测方法，其不仅具有酶联免疫吸附法的可定量优点，又兼具胶体金法的快速、简便和易操作的优点，并可现场进行检测，对于基层食品安全监管具有重要的意义和广阔的应用前景。本标准旨在建立动物源性食品中金刚烷胺的量子点微球荧光免疫层析方法，用于动物源性食品中金刚烷胺的快速和定量检测。该标准的建立可方便基层农产品检测部门、市场监管部门、大型商超农贸市场以及农产品种植户对畜禽、水产等动物组织中的金刚烷胺进行快速、准确及定量的检测，实现对动物源性食品安全有效的监管，保障食品的质量安全。1.3协作单位协作单位为江西省市场监督管理局、江西省检验检测认证总院、江西维邦生物科技有限公司1.4主要工作过程(1)2022年7月，成立标准起草组，查询了国内外资料，对各级市场监督管理机构、农业部门、相关检测机构和农产品种植加工企业进行了调研，并召开了第一次标准起草讨论会，确定了标准制订方案和工作计划。(2)2022年7月至2022年8月，在南昌大学和协作单位进行标准的制定工作，主要包括方法的建立，检出限和定量限测试，标准曲线的建立和线性范围确定，方法的准确度、回收率和重复性研究等。(3)2022年8月中旬，开展了实验室间的方法验证，编写了《动物源性食品总金刚烷胺的检测量子点微球荧光免疫层析法》标准草案及编制说明。(4)2022年9月，由起草单位进行征求意见，发出10份，收回10份，收回共计41条意见，采纳40条，不采纳1条，主要涉及格式以及文本的规范性等问题，未收到重大分歧意见。现己按照反馈意见修改，形成征求意见稿。2.标准的编制原则和标准的主要内容（如技术指标、参数、公式、性能要求、实验方法、检验规则等）的论据（包括实验、统计数据）。修订标准时，应列出与原标准的主要差异和水平对比2.1标准编制原则本标准根据GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构与编写和起草规则》和GB/T20001.4-2015《标准编写规则第4部分：实验方法标准》的规定进行编制。2.2确定标准主要内容2.2.1标准的适用范围本标准规定了动物源性食品中金刚烷胺量子点微球荧光免疫层析方法的原理、试剂材料、仪器设备、样品前处理、检测步骤、结果表述和基本性能参数。本标准适用于畜禽组织和水产组织中金刚烷胺的快速定量检测。2.2.2标准研制的总体思路（1）最佳反应时间优化将喷涂好3μL/cm金刚烷胺量子点荧光微球标记物的材料组装成大板，切成4mm宽的试纸条，放入卡壳中组装好，分别取浓度为0和0.1ng/mL的金刚烷胺标准品90μL加入到检测卡加样孔中，2min后开始用荧光读取仪检测试纸条T、C线荧光强度及计算T/C值，此后每间隔0.5min读取一次，跟踪记录20min，具体结果见图2。由图2可知，T/C值随着反应时间的延长在逐渐变小，10min后T/C值的下降均趋于稳定，故本实验最后确定试纸条的结果判读时间为加样后10min。图2金刚烷胺项目最佳反应时间优化（2）溶液pH对试纸条的影响使用阴性鸡肉和猪肉组织基质，制备加标阳性样本，金刚烷胺加标浓度为1μg/kg，样本提取后分别采用不同pH（pH5.0、6.0、7.0、8.0和9.0）的样本稀释液进行稀释。评价pH对试纸条T/C比值和抑制率的影响，从图3中可以看出，当pH值在7.0时，抑制率最优，因此，本实验选用0.01M，pH7.0的PBS为样本稀释液。图3溶液pH对试纸条的影响（3）检测标准曲线的建立选用混合鸡肉和猪肉样品，采用空白基质加标的方式制备阳性样品，加标浓度为0、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4和12.8μg/kg），每个浓度制备2个试样。准确称取2g±0.1g样本于50mL离心管中，向上述离心管中加入2mL金刚烷胺（组织）样本提取剂A，漩涡振荡混匀2分钟，再加入1mL金刚烷胺（组织）样本提取剂B及4mL乙酸乙酯，手动剧烈上下摇晃15次后漩涡震荡混匀30秒（注意涡旋时盖紧离心管盖，以免漏液），4000rpm离心2分钟，准确吸取2mL上清（注意不能吸入样本组织）于10mL离心管，放置于65℃浓缩仪中吹干10分钟，向吹干的离心管中先加入1mL正己烷，漩涡振荡混匀10秒钟，溶解离心管底及内壁固体残留物，再加入0.5mL金刚烷胺（组织）样本复溶液，轻轻颠倒40次（请勿振荡），静置2分钟后下层溶液即为备用待测液。将检测卡平放在恒温孵育器上，用移液器吸取90μL稀释后的待测液加入检测卡加样孔（S）中，37℃孵育反应10分钟，用荧光免疫分析仪进行检测，记录T/C值，计算每个浓度4个测值的均值（两种基质，每种基质重复2次），绘制标准曲线如图4：图4金刚烷胺标准曲线上述结果可知：以金刚烷胺浓度的对数为横坐标并以T/C值数据为纵坐标作图，建立标准竞争抑制曲线。该标准曲线线性回归方程为y=-1.611log(x)+17.2206，回归系数R2=0.9871，定量检测范围为0.3~6μg/kg，IC50为1.096μg/kg。金刚烷胺标准曲线可以以ID卡的形式内置于荧光读取仪中，不同检测样本基质可使用同一条标准曲线进行定量检测。（5）方法检出限和定量限依据GB/T27417《合格评定化学分析方法确认和验证指南》中的规定，连续独立检测20个空白样品，检出限为20个空白样品测定平均值加上3倍标准偏差，定量限为20个空白样品测定平均值加上10倍标准偏差，计算得出本方法的检测限和定量限，数据见表1。表1金刚烷胺量子点微球荧光免疫层析法的检出限和定量限单位（mg/kg）猪肉样本鸡肉样本阴性测值均值（n=20）0.020.03标准偏差SD0.020.02检出限（LOD）0.070.09定量限（LOQ）0.200.23（6）方法的准确度采用本方法对添加金刚烷胺的猪肉和鸡肉样品进行检测。两种基质中金刚烷胺的添加量参照GB31660.5《动物性食品中金刚烷胺残留量的测定液相色谱-串联质谱法》方法中的检测限（1μg/kg），选择低、中、高三个浓度水平分别为1μg/kg、2μg/kg和4μg/kg，每个加标水平进行6次重复实验。如表2所示，金刚烷胺在两种基质中的三个添加浓度的回收率在86.83%~101.92%，变异系数CV小于等于12.24%；说明本方法准确度满足要求。表2金刚烷胺在猪肉和鸡肉样本中的添加回收率样本类型加标浓度（μg/kg）123456平均值（mg/kg）回收率%标准偏差SDCV%猪肉10.850.810.850.831.080.790.8786.830.1112.2421.711.822.211.801.952.011.9295.830.189.3843.563.854.254.123.653.893.8997.170.266.81鸡肉11.111.070.890.851.020.910.9897.500.1110.8922.232.161.891.921.852.182.04101.920.178.3043.413.423.523.653.683.663.5688.920.123.47（7）方法的重复性依据GB/Z22553-2010，计算测量值的重复性标准差（也称为相对标准偏差），用同一批检测卡检测中浓度水平的猪肉和鸡肉样品，每个样品重复称样检测6次，重复性的相对标准偏差（RSD）应小于15%，相对标准偏差计算公式为：RSD=S/X×100%，其中S为标准偏差，X为算数平均值。测定结果见表3。表3金刚烷胺重复性结果分析金刚烷胺样本类型测值（μg/kg）平均值标准偏差S相对标准偏差RSD%猪肉1.741.951.781.942.352.021.960.2211.09鸡肉2.252.022.352.112.252.002.160.146.54由表4结果可见：金刚烷胺两种样本在加标2μg/kg浓度下，其相对标准偏差RSD分别为11.09%和6.54%，均小于15%，符合要求。（8）特异性目标分析物及其结构类似物的标准品用缓冲液配制成系列梯度浓度，做出标准曲线，得出IC50（半抑制浓度）后按照式（1）计算交叉反应率。（1）交叉反应物质配置初始浓度：金刚乙胺、金刚烷甲酸、利巴韦林、对乙酰氨基酚、达氟沙星、喹乙醇、氯霉素用缓冲液配制为100μg/mL浓度，阳性对照金刚烷胺浓度为0.1μg/mL。通过公式计算交叉反应率来评价该方法的特异性，每次检测均重复3次，结果见表4。表4：金刚烷胺交叉反应结果标品名称交叉反应率%金刚烷胺100金刚乙胺＜0.1金刚烷甲酸＜0.1利巴韦林＜0.1对乙酰氨基酚＜0.1达氟沙星＜0.1喹乙醇＜0.1氯霉素＜0.1实验结果表明该方法对上述化合物的交叉反应均小于0.1%，证明该方法的特异性满足要求。（9）实际样品的分析使用检出金刚烷胺的真实样本进行实际样本的分析，样本来源于江西省食品检验检测研究院和江西省农产品质量安全检测中心在例行抽查中检出的金刚烷胺阳性和阴性样本，样本编号见表5。《国家食品安全监督抽检实施细则》（2021年版）规定动物性食品中金刚烷胺残留的检测方法为《食品安全国家标准动物性食品中金刚烷胺残留量的测定液相色谱-串联质谱法》（GB31660.5-2019），将仪器方法检测结果与本方法的测值进行显著性差异分析，具体数据见表5。表5金刚烷胺实际样本的测定结果样本类型样本编号本方法测定值（μg/kg）参比方法测定值（μg/kg）猪肉ZR-001＜0.1NDZR-002＜0.1NDZR-003＜0.1NDZR-0043.172.99ZR-005＜0.1NDZR-0060.530.41ZR-0071.721.52鸡肉JR-001＜0.1NDJR-0020.360.44JR-0030.910.81JR-0045.104.17JR-005＜0.1NDJR-006＜0.1NDJR-007＜0.1ND与参比方法一致性分析统计方法可采用卡方（c2）检验按照式（2）进行计算:c2=(C-B-1)2式中：C——样品被快检方法证实为阳性而参比方法检验为阴性的数目；B——样品被快检方法证实为阴性而参比方法检验为阳性的数目。卡方（c2）检验结果按以下方法进行分析：c2＜3.84，表示快检方法与参比方法的阳性确证比率在95%的置信区间内没有显著性差异。c2＞3.84，表示两种方法的阳性确认比率在95%的置信区间内有显著性差异。由表5中数据进行计算，金刚烷胺卡方检验c2均＜3.84，因此本方法与参比方法的阳性确证比率在95%的置信区间内没有显著性差异。（10）方法的验证本方法目前已经在南昌海关技术中心、江西省农业科学院农产品质量安全与标准研究所和江西华中检验检测科技有限公司等三家单位进行验证，验证样本包括空白的猪肉及鸡肉的低、中、高浓度的阳性添加样本。详细验证结果见验证报告。=1\*GB3①检出限和定量限由表6可知，三家单位测定的金刚烷胺的检出限和定量限基本一致，检出限在0.07-0.09μg/kg之间，定量限在0.20-0.23μg/kg之间。表6三家验证单位测定的检出限和定量限验证单位验证项目检出限（μg/kg）定量限（μg/kg）猪肉鸡肉猪肉鸡肉南昌海关技术中心金刚烷胺0.080.090.210.23江西省农业科学院农产品质量安全与标准研究所金刚烷胺0.07480.08640.20110.2309江西华中检验检测科技有限公司金刚烷胺0.080.090.210.22=2\*GB3②准确度和重复性由表7可知，三家单位测定两种不同基质的低、中、高三个浓度的添加样本的回收率均在80-120%之间，标准偏差使用三批产品进行检测，每批检测10个重复样本，RSD均小于15%。表7三家验证单位测试的准确度和重复性验证单位验证样本添加浓度（μg/kg）回收率（%）添加浓度（μg/kg）三批产品RSD（%）南昌海关技术中心猪肉1109.03210.992106.687.334108.4211.91鸡肉1107.46210.152110.188.204104.669.00江西省农业科学院农产品质量安全与标准研究所猪肉1113.94211.002114.588.584108.5410.94鸡肉1106.40211.772108.007.344103.878.02江西华中检验检测科技有限公司猪肉1104.0029.942103.818.064113.0411.06鸡肉1100.99212.672105.288.684108.909.60=3\*GB3③假阴性和假阳性南昌海关技术中心检测金刚烷胺猪肉和鸡肉样本阴性结果应为50个，阳性结果应为110个，实际阴性结果为50个，阳性结果为110个，计算假阴性和假阳性率均为0%江西省农业科学院农产品质量安全与标准研究所检测金刚烷胺猪肉和鸡肉样本阴性结果应为50个，阳性结果应为110个，实际阴性结果为50个，阳性结果为110个，计算假阴性和假阳性率均为0。江西华中检验检测科技有限公司检测金刚烷胺猪肉和鸡肉样本阴性结果应为50个，阳性结果应为110个，实际阴性结果为50个，阳性结果为110个，计算假阴性和假阳性率均为0。3．主要试验（或验证）情况的分析、综述报告，技术经济论证，预期的经济效果本方法的检出限为0.1μg/kg，定量限为0.3μg/kg。性能