新教材高中生物选择性必修3课件：3 2 1 目的基因的筛选与获取和基因表达载体的构建(人教版)

第2节基因工程的基本操作程序第1课时目的基因的筛选与获取和基因

表达载体的构建知识点1知识点2课时作业随堂检测///////1245/////////////////////网络构建·晨读必背3///////目的基因的筛选与获取1联想质疑自主梳理素养提升1.筛选合适的目的基因预期表达产物蛋白质毒物降解已知结构功能清晰2.利用PCR获取和扩增目的基因(1)原理：DNA半保留复制(2)PCR反应的条件参与的组分在DNA复制中的作用DNA母链提供DNA复制的______4种脱氧核苷酸合成DNA子链的原料________(体外用高温代替)打开DNA双链(耐高温的)DNA聚合酶催化合成DNA子链引物(长度通常为20～30个核苷酸)分为2种，分别与两条模板链结合，使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸温度控制温度使DNA复制在体外反复进行缓冲液(含Mg2＋)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要______激活Mg2＋模板解旋酶(3)PCR扩增的过程(如图)受热变性引物

耐高温的DNA聚合酶(1)用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列()(2)PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶()(3)PCR技术中，DNA模板链上碱基G和C的比例越高，DNA变性解链的温度就越高。()(4)PCR除需要耐高温的DNA聚合酶、解旋酶、4种脱氧核苷酸和DNA模板之外，还需要引物等基本条件。(

)提示：PCR不需要解旋酶的参与。(5)PCR的每一个循环都包括变性→复性→延伸三个步骤，延伸后的产物又可以作为下一个循环的模板。(

)√×√×√下图表示PCR的前三个循环，目的基因位于模板DNA分子中与两种引物所对应的位置之间，请据图回答下列问题科学探究——PCR(1)经过第几轮扩增后，扩增出的含有目的基因的DNA片段才不含黏性末端？比例是多少？提示：第3轮；1/4。(2)PCR扩增的是完整的模板DNA分子吗？提示：不是，PCR扩增的仅仅是两种引物之间所对应的特定DNA片段。(3)如果已知某目的基因的序列和结构，利用PCR筛选和扩增出该目的基因的关键是什么？提示：根据目的基因两端的核苷酸序列设计引物。[典型例题]

(2021·河北邯郸调研)关于PCR技术的说法不正确的是(

)A.PCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列B.PCR过程中只需要两个引物分子C.PCR的主要过程包括变性、复性、延伸，其中延伸阶段需要耐高温的DNA聚合酶D.PCR过程中DNA合成方向是5′到3′解析PCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，用于延伸子链，A正确；PCR过程中只需要两种引物分子，每条新的子链延伸都需要一个引物，B错误；PCR的主要过程包括变性、复性、延伸，其中延伸阶段需要耐高温的DNA聚合酶，C正确；PCR过程中DNA合成方向是5′到3′，D正确。B[变式训练]

(2021·山东济南调研)下图表示形成cDNA并进行PCR扩增的过程。据图分析，下列叙述正确的是(

)DA.①过程所需的原料是核糖核苷酸 B.②过程所需的酶必须耐高温C.③过程需要解旋酶破坏氢键 D.④过程的引物对之间不能互补配对解析①过程为逆转录，所需的原料是脱氧核苷酸，A错误；②过程由DNA单链合成DNA双链过程所需要的DNA聚合酶不需要耐高温，B错误；③过程为变性，温度超过90℃时，双链DNA解聚为单链，不需要DNA解旋酶破坏氢键，C错误；④过程为复性，温度降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条DNA单链结合，但引物对之间不能互补配对，D正确。在获得转基因产品的过程中，还可以通过构建基因文库来获取目的基因。另外，也可以采用人工合成目的基因的方法。

PCR需要的引物数量1个模板DNA分子经过n轮PCR，可以扩增出2n个DNA片段，共需要引物数量为2n＋1－2个。

(1)PCR扩增特点：使目的基因的核苷酸序列以指数形式(约为2n，n为扩增循环的次数)扩增。(2)PCR产物鉴定方法：常利用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物

1.细胞内DNA复制时是否需要引物？为什么？

提示：需要；因为DNA聚合酶不能从头开始合成DNA单链，只能将游离的脱氧核苷酸连接在一条DNA单链的3′端，所以在延伸子链前，需要提前合成一小段RNA或DNA作为引物。2.PCR过程中，如果两种引物之间互补序列较长的话，会有什么样的结果？

提示：可能造成复性过程中，引物之间相互结合，从而使引物不能很好地与模板DNA链结合。3.用PCR可以扩增mRNA吗？

提示：不能。PCR的原理是DNA复制，只可用于扩增DNA。基因表达载体的构建2联想质疑自主梳理1.操作目的

使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时，使目的基因能够____________作用。表达和发挥2.基因表达载体的组成及其作用

一个基因表达载体的组成，除了目的基因、__________外，还必须有启动子、终止子等(如图所示)。标记基因RNA聚合酶鉴别3.基因表达载体的构建过程(1)用一定的限制酶切割载体，使其出现一个有黏性末端(或平末端)的切口。(2)用同种或产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。(3)加入适量DNA连接酶，使切下的目的基因片段拼接到载体的切口处(如图所示)。(1)基因工程操作程序的核心步骤是目的基因的获取()(2)基因表达载体中有的含有启动子和终止密码子()(3)标记基因不一定是抗生素抗性基因()××√[典型例题]

(2021·湖北襄阳四中)如图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性内切核酸酶。下列说法错误的是(

)BA.卡那霉素抗性基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来B.表达载体构建时需要用到限制酶SmaⅠC.图示过程是基因工程的核心步骤D.除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构解析卡那霉素抗性基因是标记基因，目的是便于鉴定和筛选含有目的基因的细胞，A正确；构建基因表达载体过程中需要将目的基因完整切割下来，此时要用到限制酶PstⅠ、EcoRⅠ，B错误；图示过程为基因表达载体的构建过程，是基因工程中的核心步骤，C正确；基因表达载体包括启动子、目的基因、终止子和标记基因等，D正确。[变式训练]

(2021·山东枣庄八中月考)以下关于基因表达载体的构建的说法正确的是(

) A.基因表达载体的构建是在生物体的细胞内完成的 B.基因表达载体中只有启动子才能驱动目的基因转录出mRNA C.基因表达载体的组成应包括启动子、终止密码子、目的基因、标记基因等 D.基因表达载体通常采用抗生素合成基因作为标记基因

解析基因表达载体的构建是在生物体外完成的，A错误；基因表达载体的组成应包括启动子、终止子、目的基因、标记基因等，终止密码子位于mRNA上，C错误；基因表达载体通常采用抗生素抗性基因作为标记基因，D错误。B一个质粒是否只能插入一种目的基因？提示：不是，质粒上有多个限制酶的切割位点，所以可以插入多种目的基因。(1)“单酶切法”和“双酶分别切割法”均能成功构建基因表达载体；(2)与“单酶切法”相比，“双酶分别切割法”不要求载体和目的基因两侧具有同一种限制酶的识别序列，只要两种限制酶切割后形成的黏性末端是互补(相同)的即可，具有一定程度的灵活性；(3)“单酶切法”和“双酶分别切割法”都不能避免载体和目的基因的自身环化，也都不能避免载体与目的基因的反向连接。

网络构建·晨读必背3思维导图基因PCR限制酶同种连接酶晨读必背1.培育转基因抗虫棉需要4个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。2.苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白(Bt抗虫蛋白)，破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。3.PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，需提供DNA模板，分别与两条模板链结合的2种引物，4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶；同时控制温度使DNA复制在体外反复进行。每一次循环一般可以分为变性、复性和延伸三步。4.一个基因表达载体的组成，除目的基因、标记基因外，还必须有启动子、终止子等。5.在构建基因表达载体时，首先会用一定的限制酶切割载体，然后再用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段；再利用DNA连接酶连接形成重组DNA分子。随堂检测41.(2021·漯河四高期末)下列关于PCR的叙述，错误的是(

)A.PCR只能扩增引物之间的DNA片段而非整个完整的模板DNA分子B.PCR过程中变性的目的是让引物与模板DNA单链结合C.PCR的原理是DNA半保留复制D.PCR的过程需要耐高温的DNA聚合酶但不需要解旋酶解析变性的目的是通过升高温度，破坏氢键，打开模板DNA分子，为子链的延伸提供模板。BD2.(2021·北京四中期末)下图是基因工程主要技术环节的一个基本步骤，这一步需用到的工具是(

)A.DNA连接酶和解旋酶B.DNA聚合酶和RNA聚合酶C.DNA聚合酶和限制性内切核酸酶D.限制性内切核酸酶和DNA连接酶

C3.(2021·吉林长春期末)科学家运用基因工程技术将人胰岛素基因与大肠杆菌的质粒DNA分子重组，使其在大肠杆菌体内成功表达。它们彼此能结合的依据是(

) A.基因的遗传定律

B.中心法则 C.碱基互补配对原则

D.半保留复制原则

解析DNA连接酶是连接两个DNA片段，形成磷酸二酯键。黏性末端依赖于碱基互补配对原则将碱基连接起来，并形成氢键，生成重组DNA分子，故选C。4.(2021·太原五中调研)下列有关基因表达载体的叙述，不正确的是(

)A.具有复制原点，使目的基因能在受体细胞内扩增B.具有启动子，使DNA聚合酶识别并开始转录C.具有标记基因，有利于鉴别受体细胞中是否含有目的基因D.具有目的基因，以产生特定的基因产物解析基因表达载体中具有复制原点，使目的基因能在受体细胞内扩增，A正确；基因表达载体中具有启动子，使RNA聚合酶识别并开始转录，B错误；标记基因的作用是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，所以基因表达载体中具有标记基因，有利于鉴别受体细胞中是否含有目的基因，C正确；基因表达载体中应具有目的基因，以产生特定的基因产物，D正确。B5.(2021·山西省长治市联考)下列关于基因工程的叙述，不正确的是(

)A.基因载体的种类有质粒、噬菌体和动植物病毒等B.EcoRⅠ这种限制酶能够专一识别GAATTC的核苷酸序列C.基因工程的第二步骤是目的基因与载体结合D.由于变异是不定向的，所以基因工程也不能定向改造生物的性状解析基因载体的种类有质粒、噬菌体和动植物病毒等，A正确；限制酶具有专一性，如EcoRⅠ这种限制酶能够专一识别GAATTC的核苷酸序列，并切割G和A之间的磷酸二酯键，B正确；基因工程的第二步骤是目的基因与载体结合，即构建基因表达载体，C正确；基因工程能够按照人们的意愿定向改造生物的性状，D错误。D课时作业5知识点1目的基因的筛选与获取1.(2021·渭南市期中)下列不属于获取目的基因的方法是(

)A.从基因文库中提取

B.利用PCR技术合成C.利用DNA转录合成

D.利用化学方法人工合成解析可以从基因组文库中获取目的基因，A正确；可以利用PCR技术扩增目的基因，B正确；利用DNA转录合成的是RNA，不是基因，C错误；可以利用化学方法人工合成目的基因，D正确。C2.(2021·泉州市期末)下面关于多聚酶链式反应(PCR)的叙述正确的是(

)A.PCR过程中只需要两个引物分子B.PCR的循环过程分为变性、复性和延伸三步C.PCR扩增仪需保持在37℃以维持Taq酶最佳活性D.PCR过程中边解旋边复制解析PCR过程中需要两种引物，引物的数目需要根据扩增的次数确定，A错误；PCR的循环过程分为高温变性(DNA双链打开)、复性(模板链与引物结合)和延伸(合成子链)三步，B正确；PCR扩增仪温度有时会达到90℃以上，C错误；PCR过程中，在变性阶段打开双链，延伸阶段合成子链，故先解旋再复制，D错误。B3.(2021·江西临川期末)有关PCR技术的说法错误的是(

)A.PCR是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术B.高温变性过程中被切断的是DNA分子内碱基对之间的氢键C.PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行D.PCR扩增中必须有解旋酶才能解开双链DNA解析PCR是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术，A正确；利用PCR技术扩增目的基因的过程是：高温变性、低温复性、中温延伸，其中高温变性过程中被切断的是DNA分子内碱基对之间的氢键，B正确；PCR反应需要适宜的pH值，故需要在一定的缓冲溶液中才能进行，C正确；PCR扩增中没有使用解旋酶，而是利用高温将双链DNA解开，D错误。D4.(2021·辽宁鞍山一中期中)RT－PCR是将RNA逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增反应相结合的技术，可利用此技术获取目的基因，具体过程如图所示，以下说法错误的是(

)CA.设计扩增目的基因的引物时需考虑基因表达载体的序列B.GC含量高的引物在与模板链结合时，需要更高的温度C.过程Ⅰ需要加入缓冲液、原料、耐高温的DNA聚合酶和引物A等D.该技术用于对某些微量RNA病毒的检测，可提高检测的灵敏度解析设计扩增目的基因的引物时，引物应当可以与表达载体两端的序列进行互补配对，所以设计引物时需考虑基因表达载体的序列，A正确；GC对之间有三个氢键，GC含量高时稳定性高，所以需要更高的温度，B正确；过程Ⅰ是逆转录过程，所以需要加入缓冲液、原料、逆转录酶和引物A等，C错误；该技术用于对某些微量RNA病毒的检测，可提高检测的灵敏度，D正确。5.(2021·山东枣庄八中月考改编)利用PCR将某小段含目的基因的DNA分子扩增循环n次，则(

) A.需要已知目的基因的全部序列以便设计引物 B.共需2n＋1－2个引物参与子代DNA分子的合成 C.应向反应体系中加入解旋酶、DNA聚合酶、缓冲液等 D.理论上第4轮循环产物中含两种引物的DNA片段占15/16

解析只需要已知目的基因两端的序列便可设计引物，A错误；扩增循环n次，需一种引物的数量为2n－1，常规PCR共需两种引物的数量为2×(2n－1)＝2n＋1－2，B正确；不需向PCR的反应体系中加入解旋酶，C错误；理论上第4轮循环产物中含两种引物的DNA片段占(24－2)/16＝7/8，D错误。B6.(2021·河北保定调研)如图表示基因工程中获取水稻某目的基因的不同方法。下列叙述正确的是(

)DA.方法a不遵循中心法则B.①②碱基对的排列顺序相同C.图示三种方法均属人工合成法D.图示三种方法都需酶并均在体外进行解析方法a中逆转录是以mRNA为模板合成DNA的过程，遵循中心法则，A错误；利用方法a得到的目的基因不含内含子等，利用方法b得到的目的基因中可能含有内含子等，故①②碱基对的排列顺序可能不同，B错误；用方法b获得的目的基因是天然的，不是人工合成的，C错误；方法a需要逆转录酶，方法b需要限制酶，方法c也需要酶，三者均在体外进行，D正确。知识点2基因表达载体的构建7.(2021·天津高二期末)关于基因表达载体的说法不正确的是(

)A.基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤B.基因表达载体包含启动子、目的基因、终止子、标记基因等C.启动子位于目的基因的首端，能够启动翻译D.不同的目的基因所需的启动子不一定相同解析基因表达载体使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用，是基因工程的核心步骤，A正确；基因表达载体包括启动子、终止子、目的基因、标记基因，其中启动子位于目的基因的首端，终止子位于目的基因的末端，B正确；启动子位于目的基因的首端，是启动转录的一段DNA，C错误；不同的目的基因具有不同的核苷酸序列，其启动子也不尽相同，D正确。C8.(2021·乌鲁木齐市期末)在基因工程的操作过程中构建重组质粒不需要(

)①DNA连接酶②同一种限制酶③DNA聚合酶④具有标记基因的质粒⑤目的基因⑥4种核糖核苷酸A.③⑥ B.②④ C.①⑤ D.①②④解析DNA连接酶将具有相同黏性末端的目的基因和载体连接起来，①正确；同一种限制酶切割目的基因与载体，形成相同的黏性末端，②正确；DNA复制过程中需要DNA聚合酶，但是在基因工程的第二步中不需要，③错误；具有标记基因的质粒作为载体，以便进行目的基因的检测，④正确；基因表达载体中含有目的基因、启动子、终止子和标记基因等，⑤正确；合成目的基因时需要4种脱氧核苷酸，但基因表达载体的构建不需要，⑥错误。因此，在基因工程的操作过程中构建重组质粒不需要③⑥，故选A。A9.(2021·黑龙江铁人中学期中)如图是利用基因工程技术生产可食用疫苗的部分过程，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ和ApaⅠ为四种限制性内切核酸酶。下列说法正确的是(

)BA.图示过程需要的工具只有限制酶和载体B.限制酶识别的核苷酸序列和切割位点是特定的C.图中的质粒只能来自原核细胞D.限制酶作用于双链DNA中的氢键，将其断开解析图示过程需要的工具有限制酶、DNA连接酶和载体，A错误；限制酶也具有专一性，B正确；图中的质粒可能来自原核细胞，也可能来自真核细胞如真菌中也有质粒，C错误；限制酶作用于双链DNA中的磷酸二酯键，将其断开，D错误。10.(2021·河北石家庄调研)图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，ampr表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列叙述正确的是(

)DA.图甲中的质粒用BamHⅠ切割后，含有4个游离的磷酸基团B.在构建重组质粒时，可用PstⅠ和BamHⅠ切割质粒和外源DNAC.导入目的基因的大肠杆菌可在含氨苄青霉素的培养基中生长D.用PstⅠ酶切，无法避免目的基因和载体的自身环化解析图甲中的质粒用BamHⅠ切割后，会打开一个切口，故有2个游离的磷酸基团，A错误；在构建重组质粒时，不能用BamHⅠ切割质粒和外源DNA，会破坏目的基因，B错误；导入目的基因的大肠杆菌不能在含氨苄青霉素的培养基中生长，可以在含新霉素的培养基上生长，C错误；用同一种限制酶酶切时，无法避免目的基因和载体的自身环化，D正确。11.(2021·江苏徐州期末)某科研小组利用质粒(图甲)和目的基因(图乙)构建重组DNA。下列分析错误的是(

)CA.用限制酶HindⅢ和Pst

Ⅰ切割质粒，可得到2条DNA片段B.不能用Alu

Ⅰ酶切割质粒和外源DNA的原因是Alu

Ⅰ酶会破坏目的基因C.构建重组DNA时，需选择Sma

Ⅰ酶和PstⅠ酶同时切割质粒和外源DNAD.导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长而不能在含氯霉素的培养基上生长解析限制酶Hind

Ⅲ和Pst

Ⅰ在质粒上各有一个识别切割位点，用Hind

Ⅲ和Pst

Ⅰ切割质粒，可得到2条DNA片段，A正确；Alu

Ⅰ的识别、切割位点位于目的基因中，用Alu

Ⅰ酶切割外源DNA会破坏目的基因，B正确；选择Sma

Ⅰ酶和Pst

Ⅰ酶同时切割质粒和外源DNA，质粒中的两个标记基因均会被破坏，C错误；选择Hind

Ⅲ和Pst

Ⅰ同时切割质粒和外源DNA，会破坏质粒中的氯霉素抗性基因，保留四环素抗性基因，所以导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长而不能在含氯霉素的培养基上生长，D正确。12.(2021·浙江省杭州二中月考)下面几幅图与基因工程有关。图1为限制酶EcoRⅠ的识别序列，图2表示目的基因及限制酶切点，图3表示目的基因上的DNA片段，图4表示质粒。请回答下列问题：(1)获得图2中目的基因的方法除PCR技术外，还有___________________。(2)采用PCR扩增目的基因的原理是________________，图2中A、B、C、D4种单链DNA片段中，有________两种引物(DNA复制方向由5′→3′)。(3)图3为目的基因中的某一片段，下列有关叙述错误的是________(填下列字母，不定项)。a.该片段的基本骨架由脱氧核糖与磷酸交替连接而成b.该片段含A－T碱基对比较多，故其结构比较稳定c.若利用PCR扩增该片段，则需解旋酶将①氢键全部解开d.若该目的基因复制6次，则需要碱基A的数量是252个(4)在构建目的基因表达载体时，用Pst

Ⅰ、EcoRⅠ两种酶同时切割目的基因和质粒，是为了防止一种酶切割时产生________________，从图2切割下目的基因需要消耗________个水分子。不选用限制酶Pst

Ⅰ和Hind

Ⅲ同时对质粒和目的基因进行切割的原因是_________________________________________答案(1)从基因文库中获取、人工合成(2)DNA半保留复制B、C

(3)bcd

(4)目的基因与运载体反向连接4会破坏标记基因解析(1)获得目的基因的方法有PCR技术、从基因文库中获取、人工合成。(2)采用PCR扩增目的基因的原理是DNA半保留复制，由图2可知，DNA复制只能从5′到3′，因此构建前利用PCR技术扩增基因时，A、B、C、D四种单链DNA片段中应选取B和C作为引物。(3)DNA的基本骨架由脱氧核糖与磷酸交替连接而成，a正确；其结构中G∥C碱基对越多，分子结构越稳定，b错误；PCR技术利用高温解开氢键，不需要解旋酶，c错误；由图3可知，目的基因碱基A有2个，复制6次需要碱基A的数量为26×2－2＝126个，d错误。故选b、c、d。(4)在构建目的基因表达载体时，用PstⅠ、EcoRⅠ两种酶同时切割目的基因和质粒，是为了防止一种酶切割时产生目的基因与运载体反向连接。限制酶破坏的是磷酸二酯键，图中目的基因切割需要破坏4个磷酸二酯键，因此需要消耗4个水分子。由图可知，不选用限制酶PstⅠ和HindⅢ同时对质粒和目的基因进行切割的原因是会破坏标记基因。13.(2021·江西金太阳全国联考)图1表示含有目的基因D的DNA片段长度(bp即碱基对)和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ4种限制性内切核酸酶切割的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。请回答下列问题：图1图2(1)若用限制酶SmaⅠ完全切割图1中DNA片段，其产物长度为_________________________________________________________________。(2)若图1中虚线方框内的碱基对被T－A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。从隐性纯合子分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶SmaⅠ完全切割，产物中共有________种不同DNA片段。为了提高实验成功率，需要通过________技术扩增目的基因，以获得目的基因的大量拷贝，该技术原理为_________________________________________________________