静电自组装技术论文主题：阿加曲班,壳聚糖,透明质酸,膜修饰

I血液净化治疗已经广泛应用于多种危重疾病的治疗，其过程必然涉及到体外循环。然而由于管路、透析器/滤器等人工材料尚无法做到完全的生物相容，故凝血因子的激活无法避免。因此，改善人程学、医学的研究热点。从纤维素膜到合成膜再到膜表面改性处理，膜的血液相容性已经得到很大提高。但该类膜在临床应用中仍然离不开使用一定剂量的全身抗凝剂。血管内皮除具有完美的血液相容性外，还能够局部释放抗凝因子，因而能维持血液在血管内顺利循环。在提高膜材料的血液相容性的同时，在膜表层装载抗凝药物并实现其局部释放，作用于血流一膜接触层面，可使抗凝更有针对性，最大程度发挥膜材料局部抗凝效能，可望减少或脱离全身抗凝剂的通过静电自组装技术构建一种装载抗凝药物的修饰膜滤器，该滤器膜材料具有良好的血液相容性，同时所装载的抗凝药物能够局(1)根据静电自组装原理，将壳聚糖-阿加曲班混合溶液及透明质酸溶液交替涂敷于聚砜膜滤器膜内面，构建抗凝修饰膜滤器。(2)采用扫描电镜观察修饰膜表面形貌及厚度，跟踪观察分子自组装过程。(3)亲水角测量仪测定修饰膜表面亲水角，观察其亲水性改变。(4)在摸索测量阿加曲班浓度的高效液相色谱法所需条件的基础上，将生理盐水注入修饰膜滤器进行浸泡。分别于30min、1h、2h、3h、5h、10h、15h、20h从浸泡液中取样3ml,采用高效液相色谱法检测浸泡液中阿加曲班浓度。通过检测浓度的改变，观察膜的1扫描电镜观察修饰膜内表面：在分子自组装的过程中，膜内表面形貌从稀疏不均匀的小岛颗粒状分布到逐渐形成致密均匀的细颗粒状分布。膜的厚度在4个双分子层前无显著变化，4个双分子层后膜的厚度随着双分子层数的增加而增厚。2测定修饰膜内表面亲水角：随着两种亲水性质不同的物质交替涂敷膜内表面，膜表面的亲水角随之发生交替变化；并且随着双分子层数的增加，其亲水角不断变小。3药物缓释实验：在经过15h浸泡后，浸泡液中可以检测到阿加曲班，但此时阿加曲班的浓度未达到其有效抗凝浓度。1壳聚糖/透明质酸静电自组装可以修饰聚砜膜，综合考虑其亲水性、通透性，4个双分子层为适宜层数。2壳聚糖/透明质酸静电自组装可以装载阿加曲班，并实现阿加关键词静电自组装技术，阿加曲班，壳聚糖，透明质酸，膜修饰Bloodpurificationtherapyofmanycriticalillness,theprocesswillinevitablyinvolvecardiopulmonarybypass.However,duetopipeline,dialyzer/filterandactivationofcoagulationfactorscannotbeavoided.Therefore,improvingthebiocompatibilityofartificialmaterials,especiallythebloodengineering,medicine.Fromcellulosemembranestosynmembranes,thebloodcompatibilityofthedialysismembraneswasimprovedgreatly.Butitstillneedalittendothelialcellswithbestbloodcompatformthrombosis.So,simulatingtheendothelialcebloodcompatibilitysurface,mayimprovetheeffectivenWewillconstructanewfiltermembraneofmolecularself-assemblytechnique.Thenewtypereleaseanticoagulantlmembranefilterinturns,accordingtothepmolecularself-assemblytechnique.(1)Toconfirmeverystemolecularself-assemblecoatings,weusescanningelectronmicrtoobservethesurfacemorph(2)Toobservethechangesofmembranehydrophilicity,weusecontactanglemeasuringmachinetomeasurethehydrophilicityangleofthemembranesurface.(3)Exploretheconditionsofmeaconcentrationrequiredforhigh-performancechromatography.Thenwedoasustained-rehigh-performanceliquidchromatographytomeasuretheargatrocharacteristicsofmembraprocess,themembranesurfacemorphologygraduallychanges,fnon-uniformdistributionofislanVisevenlydistributed2Hydrophilicityangleshows:twodifferenthydrophilicappearalternately;andbimol3Theresultsofdrugrelease:argatrobanhasbeen1electrostaticmodifythesurfaceofpolysulfonemembitshydrophilicity.Toavoidaffectingthedialysisperformanceofthemembrane,fourpairsofmolecularlayersaremostsuitable.2Argatrobancanbeloadedbychitosan/hyaluronicaciKeywords:elehyaluronicacid,modifiedm硕士学位论文英文缩略词 I Ⅲ 1第二章材料与方法 4 4 5 5 65阿加曲班修饰膜滤器的表面特征观察 6 7 78统计学方法 8 9 9 9 第五章结论 23 英文缩略词硕士学位论文硕士学位论文1血液净化治疗已经广泛应用于肾衰竭、多器官功能障碍综合症、急性胰腺炎、溶血尿毒综合症等危重疾病的治疗。血液净化过程必然涉及到体外循环，由于管路、透析器等人工材料尚无法做到完全的生物相容，故凝血因子的激活无法避免。因此，抗凝是血液净化治疗的必要前提。而接受血液净化治疗的患者由于原发病的影响，很多存在一定凝血功能障碍，使抗凝方法的应用非常复杂。而到目前为此，国际上尚无统一的标准抗凝方案"。目前对抗凝方法的研究绝大部分集中于抗凝药物的应用上，对于滤器膜材料进行改进的研究较少。分子自组装(LayerbyLayerself-assembly,LBL)是指分子与分子在一定条件下依赖非共价键分子间作用力(氢键、范德华力、静电力、疏水作用力等)自发连接成结构稳定的分子聚集体的过程。静电层层自组装是分子自组装技术的一种，是基于静电相吸而产生多层膜自我组装体系的技术，最早由Decher和Hong²于1991年提出。轮流地交换吸附溶液，使两种带相反电荷的离子相互吸引结合构成多层膜结构。具体而言就是将底物上带有电荷的聚合物表面连续而又交替地沉浸在带有完全相反电荷的两种溶液中，利用静电相吸的作用，使带不同电荷的两种物质有序而紧凑地连接在一起，重复数次得到多层膜结构(如下图)。该技术对于构建生物活性的表面来说是一种简单而又高效的方法，能显著提高材料表面的生物相容性。层层自组装技术具有得天独厚的优点：(1)对材料表面的化学结构、活性官能团不作要求；(2)层状结构的构建过程不需要任何外加条件如能量的提供；(3)具有高吸收能力；(4)可以使用各种具有生物相容性的水溶性聚合物(尤其是各种生物活性的生物大分子如蛋白质、核酸),为其在生物材料表面工程应用提供了便利3。目前该技术已经广泛应用于光源、药物缓释、生物工程材料等领域。2+壳聚糖(Chitosan,CS),又名脱乙酰壳多糖，是甲壳素(壳多糖)脱乙酰化的产物，是一种重要的天然多糖，来源丰富，制备简单，它无毒无味，无刺激性，具有良好的生物相容性和生物降解性能。值得注意的是，壳聚糖是自然界中唯一的碱性多糖，是一种阳离子聚合物。透明质酸(sodiumhyaluronate,HA)是人体内广泛存在的生理物质，是由纤维母细胞合成的，分布于整个结缔组织，最重要的作用是形成松散的结缔组织。在皮肤、关节滑液、眼玻璃体、脐带等许多器官和组织中也有较高含量。透明质酸是由N-乙酰-D-氨基己糖和D-葡萄糖醛酸构成的酸性黏多糖，它是一种长线条的多聚链，是一种阴离子聚合物。Thierry⁴等在金属支架表面通过静电自组装构建了透明质酸/壳聚糖的聚电解质多层膜表面。血小板粘附实验表明多层膜修饰后，金属支架的血小板粘附量减少了38%。若在多层膜中负载药物硝普钠，血小板的粘附量进一步减少，与未修饰的支架相比粘附量减少达40%。充分证明这种利用层层自组装构建的天然聚多糖涂层可有效阻抗血栓形成。阿加曲班(argatroban)是化学合成的低分子药物，是精氨酸的衍生物，相对分子质量527U。阿加曲班能直接与凝血酶的催化活性位点(包括丝氨酸-组氨酸-精氨酸结构)结合，灭活凝血酶。由于阿加曲班分子量小，它能进入到血栓内部，直接灭活已经与纤维蛋白结合的凝血酶。其作用特点为：①直接灭活凝血酶的活性，对凝血酶的产生没有直接作用，其作用不依赖于抗凝血酶；②不但灭活液相凝血酶，还能够灭活与纤维蛋白血栓结合了的凝血酶；③阻断凝血瀑布的正反馈，间接抑制凝血酶的产生；④治疗剂量下对血小板功能无影响，不导致血小板减少症；⑤具有良好的剂量-反应关系，效果和安全性可以预测；⑥与活化部分凝血活酶时间或者活化凝血时间相关性良好5。目前应用分子自组装技术对血液净化膜表面进行修饰，以获得更好的血液硕士学位论文第一章前言3相容性膜的研究很少，且仍然达不到临床需要67。本实验在前期平面膜实验的基础上，以常用滤器膜—聚砜膜为膜基材，以透明质酸和壳聚糖为阴阳离子聚电解质，在聚砜膜表面进行静电分子自组装。同时将抗凝药物阿加曲班与壳聚糖共混，实现了阿加曲班的装载，并使其缓慢释放。4第二章材料与方法2血泵：尼普诺公司4高效液相色谱仪：[四元泵(带在线真空脱气机),自动进样器，柱温箱，可变波长紫外检测器]:美国Agilent公司8磨样机9聚砜膜滤器：费森尤斯AV400滤器10眼科手术剪刀1.2主要试剂1壳聚糖：脱乙酰度90%,粒度100目，分析纯。山东潍坊海之源生物制品2透明质酸：医用级别，中国山东福瑞达生物化工有限公司3乙酸：分析纯，长沙化工厂8乙醚：分析纯，长沙化工厂9乙酸乙酯：分析纯，长沙化工厂10异丙醇：分析纯，长沙化工厂11去离子水：湘雅医院人工肾水处理室12阿加曲班粉末：日本三菱制药厂52主要试剂的配置2.1壳聚糖溶液的配置：中。加入99%乙酸溶液，调节PH值至5.5。搅拌器搅拌1小时后室温静为2%、1%、0.5%、0.25%、0.2%、0.1%的壳聚糖溶液。2.2透明质酸溶液的配置：水中。搅拌器搅拌4小时后室温静置24小时。真空抽滤器抽滤除气泡后0.1%、0.05%的透明质酸溶液。3.1方法：①聚砜膜滤器保持直立，50ML注射器分别抽取不同浓度的壳聚糖溶液、透明质酸溶液，交替从滤器上端血液入口往下注射，从滤器下端血液出口出来。感受压力变化、观察溶液通过滤器的难易情况。纤维管，灯光下观察中空纤维管有无堵塞。③重复以上步骤，直至挑选出合适的壳聚糖、透明质酸溶液的浓度。3.2选择标准：起破膜。维管。④在涂层过程中，宜有少量碎片状、短丝型络合物形成，以免浓度过低，涂层不成功。⑤在灯光下，如果发现中空纤维管中过多黑色暗影(即被络合物堵塞),则该浓度淘汰。6阿加曲班溶液中，滴入乙酸溶液，调节PH值到5.5,搅拌器搅拌1小时后避光静置24小时。真空抽滤器抽滤除气泡后备用。③按下图所示连接设备。—管路④将去离子水放入烧杯，打开血泵，流速为80ml/min。循环10分钟。并排尽空气后，继续闭式循环30分钟，使壳聚糖-argatroban溶液与透⑥去离子水冲洗10分钟。⑦将透明质酸溶液引入循环管路，预冲并排尽空气，闭式循环30分钟后排⑧去离子水冲洗管路10分钟。⑨重复步骤⑤⑥⑦⑧5次后，氮气吹干滤器备用。5阿加曲班修饰膜滤器的表面特征观察5.1亲水角测定5.2扫描电镜观察厚度变化7把样品(约2厘米)粘贴在透明胶带上，再将此带透明胶封住一个塑料管子(底直径1.8厘米，高1厘米)的一端(样品在管子内部)。再将固化胶(树脂)倒入管子，4小时固化后将透明胶带撕掉，再过24小时之后可以磨样、抛光。取未修饰膜、涂膜4层、6层、8层、10层、12层时的修饰膜，观察膜厚预实验结果显示膜表面形貌在分子自组装涂膜8层之前变化显著,故取涂膜2层、4层、8层、10层时的修饰膜观察膜表面形貌变化，取中空纤维磨样①准备好依据步骤4制备的阿加曲班修饰膜滤器五支(其双分子层数根据接触，开始浸泡。中取样3ml,进行阿加曲班浓度检测。5支滤器每支滤器8个标本，标7.1.1检测波长的选择7.1.2流动相的选择7.1.3柱温的选择阿加曲班不耐高温，应考察30～55℃不同温度对阿加曲班色谱行为和柱效的影响。87.1.4阿加曲班的萃取条件的探索阿加曲班为精氨酸的衍生物，在甲醇中溶解，在乙醇和水中微溶，国外文献[8-10报道一般用蛋白沉淀法处理样品，样品杂质峰多，灵敏度有限。本实验采用有机溶剂萃取法处理供试品。考察不同溶剂及配比的萃取回收率，选择萃取回收率高、挥发时间短、杂质少的有机溶剂。7.1.5色谱行为的观察用抽滤器将7.1.2所选取的流动相通过0.45mm的微孔滤膜去除杂质，开机稳定半小时后。观察阿加曲班和内标物的色谱行为，绘制色谱图。7.1.6内标物质的选定根据选择的波长，选择合适的内标物，使内标在该波长时吸收峰高、并且在液相色谱法时可以与阿加曲班完全分离且分离时间与阿加曲班靠近。7.1.7标准曲线的制作以及定量下限的测定用生理盐水将标准储备液稀释成不同浓度的供试品，按7.2项操作萃取所得的沉渣用甲醇溶解，按7.3方法稳定液相色谱仪后进样。以得到的阿加曲班峰面积与内标峰面积的比值(A)对血药浓度(C)进行线性回归，得出阿加曲班标准曲线方程，并得出定量下限。7.1.8方法回收率的测定及精密度试验配制低、中、高3个浓度的阿加曲班标准供试品各5份，按7.2项操作萃取所得的沉渣用甲醇溶解，按7.3方法稳定液相色谱仪后进样。记录阿加曲班与内标的峰面积，代入回归方程计算浓度，以测得量与加入量的比值计算方法学回收率及日内精密度。连续3天配制并测定上述浓度样品，即得日间精密度。7.1.9室温放置稳定性测定配制低、中、高3个浓度的阿加曲班标准供试品各若干份，在室温下放置8h、萃取吹干后于-70℃冰箱中放置24h、样品反复冻溶3次(24h内)、冰冻(-20℃,21天)等条件下测定阿加曲班浓度考察其稳定性。7.2高效液相色谱法测定浸泡液中阿加曲班浓度依据上述步骤探索出的测定方法，对由步骤6所取得的标本中阿加曲班的浓度进行测定。每个标本重复检测5次，取均值。结果数据以x±s表示。多组间比较采用单因素方差分析，相关分析采用直线回归分析，统计分析过程用SPSS11.5统计软件完成。9第三章结果1.壳聚糖、透明质酸的合适浓度经多次试验，符合条件的壳聚糖浓度为0.25%、透明质酸浓度为0.05%。2阿加曲班修饰膜滤器的表征观察2.1亲水角变化本实验中静滴亲水角测量跟踪分子组装过程显示(见表1):在组装之前，出两种类型的亲水角交替出现，呈锯齿状变化。在涂敷4个双分子层后，亲水角显著降低。详见见表1、图1:分子自组装表层亲水角(度)硕士学位论文第三章结果02.2修饰膜厚度变化如图2所示(从上至下分别为未修饰聚砜膜、4层、6层、8层、10层、12层):PS膜未进行修饰时(0层),厚度为35.20±1.24um;涂膜至4层时，00688图2修饰膜厚度变化图样颗粒，分布欠规整，大小不一；随涂膜继续进行至4层，颗粒逐渐变得细小，大小一致，密布均匀分布于膜表面；涂膜至8层时，原膜基材表面基本被覆盖，排列整齐；涂膜8层后，膜表面形态貌不再随层数增加而发生显著变化。硕士学位论文3高效液相色谱法测定阿加曲班浓度所需色谱条件的探索3.1检测波长的选择对阿加曲班的甲醇溶液进行了紫外扫描，结果在260nm和333nm处有最大吸收峰，选择333nm作为检测波长时周围时间出峰的干扰物质少、成峰清晰、峰型对称、灵敏度好。故选择333nm做为检测波长。3.2流动相的选择阿加曲班是具有胍基和羧基为偏碱性的两性化合物，实验时直接用甲醇/水做流动相峰形分叉，不对称。而直接用乙腈/水做流动相向右拖尾严重，峰型不对称。故直接使用甲醇、水、乙腈其峰型均不符合要求，出峰时间都不能直接确定。故本实验选择了乙腈-三乙胺溶液作流动相并考察了不同的三乙胺浓度和PH值对色谱峰形及柱效的影响。三乙胺浓度在0.1%～2%之间随着浓度的升高色谱峰形的拖尾减小，峰型渐渐对称、柱效提高。但在2%～5%变化不显著,故选择2%的三乙胺做流动相。然后通过对流动相PH值的考察，发现PH值为6.95的峰形最对称、柱效最高。3.3柱温的选择考察了30～55℃不同温度对阿加曲班色谱行为和柱效的影响，随着温度的升高色谱峰形变化不明显、但柱效有少许提高。并且当柱温45℃~55℃之间时柱效3.4阿加曲班的萃取条件的探索萃取回收率，结果：乙酸乙酯与异丙醇的混合溶剂(4:1)的萃取剂回收率在80%长，需40分钟左右。故选择乙酸乙酯与异丙醇(1:4)的混合溶剂为萃取剂。本3.5色谱行为观察盐水中加入阿加曲班以及硝基安定后，阿加曲班保留时间为定为5.5min,具体色谱图见图5:3.7标准曲线的制作以及定量下限的测定用生理盐水将标准储备液稀释成0.51,1.02,2.04,4.08,8.16,20.4,51.0μg·mL¹系列浓度的供试品，以阿加曲班峰面积与内标峰面积的比值(A)对血药浓度(C)进行线性回归。得阿加曲班标准曲线方程为：A=0.021C-0.002,权重为1/C,决定系数(相关系数r²)为0.9992,线性范围为0.51～51.0μg·mL¹,定量3.8方法回收率以及精密度试验配制0.51,4.08,51.0μg·mL¹3个浓度的阿加曲班标准供试品各5份，记录阿加曲班与内标的峰面积，代入回归方程计算浓度，以测得量与加入量的比值计算方法学回收率，即得日内精密度。连续3天配制并测定上述浓度样品，即得日间精密度。结果见表2:浓度日内(intra-day)日间(inter-day)回收率回收率3.9室温放置稳定性测定结果表明阿加曲班在放置、冰冻之后稳定性均良好。4高效液相色谱法测定浸泡液中阿加曲班浓度色谱柱：KromasilC18(4.6mm×250流动相：乙腈-2%三乙胺溶液(40:60)用磷酸调ph值到6.9;柱温：45℃;紫外检测波长：333nm;内标：硝基安定萃取方法：精取0.50mL浸泡液置10mL具塞玻璃离心管中，精基安定内标溶液(202μg·mL¹),混匀，再加入3mL混合萃取液(乙酸乙酯：异丙醇=4:1),旋涡振荡1min,4000r·min¹离心8min,取有机层在35℃下用氮气吹干，残渣用100μL甲醇溶解，进样20μL。测量所得的结果见表3:表3浸泡液标本中阿加曲班的浓度浸泡时间1235生物材料(Biomaterial)是用于取代、修复活组织的天然或人造材料。它是生命科学、材料科学、医学、工程学等多学科相互渗透和发展的产物。生物材料的狭义含义是生物医用材料(BiomedicineMaterials)。按照材料的性质，生物医用材料可分为天然生物材料(如猪心瓣膜、牛心包、羊膜等)、金属材料(如钛及其合金)、无机非金属材料(如羟基磷灰石、生物玻璃等)、高分子材料以及杂化生物医用材料。对于与生物体内环境直接接触的的高分子材料(PolymerMaterials),一般应具有两种基本性能：即医用功能性和生物相容性(Biocompatibility)。实际上这也就包含了对材料其他性能如物理机械性能、化学稳定性、毒性、加工成型性等方面的要求。医用功能性是指材料在与生物体组织相结合后能达到诊断或医疗的效果。而生物相容性是指材料和活体组织之间相互容纳的程度。它包含两层含义：血液相容性和组织相容性。生物相容性是生物医用材料区别于其他材料的最重要的特征，是评价一种材料能否在生物医学领域应用的根本依据。生物医用高分子膜是膜技术在生物医药领域应用的重要部分，以高分子膜为核心元件的人工肺、人工肝、人工肾等已经挽救了成千上万生命垂危病人的生命。随着材料科学和膜技术的进一步发展，高分子膜在生物医药领域的应用前途将更加广泛。但目前应用的高分子膜均不是完全血液相容的，因此当与血液直接接触时会产生凝血现象，临床上只好采用输入抗凝剂的方法防止凝血。透析膜是透析器最重要的部分，透析膜材料是影响血液透析治疗效果的关键因素。目前，临床常用的透析膜可分为三类：1.未修饰的纤维素膜；2.改性或面均有较大的区别.目前，合成膜(包括聚丙烯腈膜、聚砜膜、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸脂酯膜、聚胺膜)由于生物相容性好、转运系数和超滤系数均较大，已经广泛应用于血液净化。然而作为一种直接与血液接触的生物材料，对血液而言透析膜毕竟是一种异体物质，始终不同于人体血管内皮细胞，与血液相接触，不可避免会引起机体的反应.提高透析膜的生物相容性，尤其是血液相容性，是当今国内外研究的热点和方向之一.理想的透析膜应与人体的血管内皮性能极为接近，无毒性，无抗原性，不激活补体、白细胞和单核细胞，无细胞因子的释放，对凝血系统也没有影节膜表面的微观不均匀性，改善膜表面的亲水性，减少透析膜对凝血及氧化应激的影响，从而提高膜的透析充分性和生物相容性，减少并发症的发生。血液相容性(Blood-compatibility)是指材料与血液接触后，不引起血浆蛋白的变性，不破坏血液的有效成分，不导致血液的凝固和血栓的形成。当血液在以内皮细胞为内壁的血管中正常流动时，一般不与血液相接触时，血液的流动状态和血管壁状态都发生了变化，材料被生物体作为异物而识别，二者界面在发生了一系列复杂的相互作用后，产生凝血现象。其原理如下：首先，小分子(水和无机盐等)和血浆蛋白(包括部分凝血因子、抗凝血因子)相继吸附在材料表面，形成一蛋白质吸附层。这一过程十分迅速，大约只需几秒。材料的表面性质极大地影响着吸附蛋白层的数量、组成、结构，这对血栓的形成起重要作用。其次，吸附在材料表面的蛋白质变性、活化。在Ca²存在的条件下，通过激活凝血因子、血小板粘附、红细胞粘附三条途径，最终导致血栓的形成。其中以凝血因子的激活和血小板粘附起主导作用，而这两者之间又相互影响，相互促进。同时，由于生物体系还存在着抗凝血系统负反馈机制，如抗凝血因子体系、抗血小板体系、纤维蛋白溶解体系等，也将受到材料表面性质的影响，与凝血系统协同作用，决定材料表面凝血反应的速度与程度。材料与血液接触后，不形成不可逆的血栓过程，称为具有抗凝血性(Antithromboeicity)。依据材料表面的凝血机制，形成血栓的任何一个环节受到抑制或阻断，都可得到良好的抗凝血性。就目前而言，抗凝血高分子生物材料(AntithromboeicityBiomedicineMaterials)的设计大致从以下几个方面着手：1.材料表面的接技改性。材料表面的接枝改性(Graft-modified)是从减少材料与血液成分相互作用，阻抗血浆1e。2.材料表面负载电荷。静电排斥作用可以阻碍血浆蛋白及血小板等物质的吸附，从而有利于抗凝血。3.材料表面生物化。将具有抗凝血功能的生物活性物质通过共价键合、离子键合、交联、吸附等方式负载到材料表面是提高血液相容性化是抗凝血的研究的新动向。目前，表皮伪内膜的聚四氟乙烯人工血管已在国内临床上得到了应用20。静电层层自组装可以控制自组装膜的结构和厚度，并且由于静电相互作用的非特异性，可以较容易地将生物功能大分子、导电聚合物、感光聚合物引入到薄膜中去，形成具有生物功能、导电功能和光活性的薄膜。其工艺简单，制备条件温和，可实现多种生物分子的表面固定。且有序的组装体可保护生物大分子的二级结构和生物稳定性，适用于具有复杂体型结构的材料，已成为生物医用材料表骨素(带负电荷)和壳聚糖(带正电荷)作为生物功能大分子，对透析器膜表面进行修饰。结果证明：经过四个双层装载后(硫酸软骨素层与血液接触),接触角以及膜zeta电位达到一个稳定值。经过修饰后，膜的亲水性、生物相容性可大大提高。与血液接触的硫酸软骨素层可以抑制血小板黏附和血浆纤维蛋白原吸附，明显延长凝血时间。另外经过修饰的膜还具有一定的抗菌能力。阿加曲班(AG)属于新型直接凝血酶抑制剂，通过直接灭活凝血酶的活性发挥作用，另外由于阿加曲班分子量小，它能进入到血栓内部，直接灭活已经与纤维蛋白结合的凝血酶。其起效迅速、半衰期短、化学性质稳定，适合作为局部壳聚糖(chitosan,CS)分子式为(C6H11NO4)n,其分子链每一个糖单元带有一个氨基，其氮原子上有一对未结合的电子，使氨基呈弱碱性，能结合一个氢离子，从而使CS成为带阳性电荷的聚电解质，能与阴离子聚电解质通过静电相互作用进行分子自组装。在酸性条件下，CS表现为一种线性高分子聚电解质，更有利于进行分子自组装26]。透明质酸(HA)分子式为(C14H21NO11)n,其分子链上每一个二糖单元带有一个羧基，易失去一个氢离子而带阴性电荷，能与阳性聚电解质进行分子自组装。CS和HA对机体无毒、无热原反应，具有良好的生物相容性、成膜性和一定的抗菌性能，且原料来源丰富，制备技术成熟，因而被广泛应用于医用材料表面修饰，为静电分子自组装常用的IC²8和ChiHJ等2利用CS和HA作为阴阳离子聚合物在多种材料表面实现了分子自组装。故本实验以CS和HA作为阴阳离子聚合物对聚砜膜表面进行分子自组装。对于带异种电荷的高分子聚电解质组装成膜的机理，Lowack³0等人通过对膜体系中各种作用力的研究，提出了控制聚电解质复合膜自组装的分1)在成膜时，在带相反电荷的链段之间形成了离子键，聚电解质的化学组成对膜的影响很小；2)表面电荷过度补偿；3)静电排斥作用，限制了聚电保证了连续吸附层具有相同的厚度；4)等温吸附线中强的滞后现象，使多层膜在刷洗过程中具有适宜的稳定性。本实验通过扫描电镜测量其厚度可知：在涂膜8层之前，膜厚度变化不显著。从第8层开始，膜的厚度开始出现线性增加。随着自组装的继续进行，膜的厚度也在不断增加，且每个双分子层的厚度大致相同。为不影响其通透性能，选用4个双分子层比较适宜。LudovicRichert等311曾以CS和HA为组装高分子聚合物，采用分子自组装构筑了多层膜，并就分子自组装的过程作了专题探讨，认为：静电分子自组装的过程大致可分为两个阶段，首先是高分子聚合物在基材表面呈液滴状分布阶段，该阶段为分子自组装的初期，聚合物因静电作用力吸附于膜基材表面，同时又因本身分子间作用力使有限的分子聚集成团，而出现小岛状颗粒；接下来，随自组装继续进行，分子间作用力使越来越多的分子连接成片，表现为小岛状颗粒开始连接，并且呈膜状在基材表面铺展。本实验以CS和HA为组装分子对，并将AG和CS混合，随CS的组装而实现AG的装载，并对分子组装过程进行了观察，所得结果与其报道基本一致。扫描电镜观察结果显示，膜修饰的初期，PS表面出现小岛状稀疏分布颗粒，之后颗粒变细、变密，随膜修饰的继续进行，表面颗粒出现一个从稀疏不均匀分布到致密均匀分布的渐变过程，说明修饰过程使膜表面成功的涂敷了一层新的物质。亲水角是判定物质亲水性能的重要因素，因其测量方便、快速，故广泛用于研究材料表面性质研究。物质分子结构不同及其所含极性基团不同，因而具有不同的亲水性。壳聚糖与透明质酸所含基团不同，其具有不同的亲水性。透明质酸是链状聚合物，由(1-β-4)D-葡糖醛酸(1-β-3)N-乙酰基-D-氨基葡糖的双糖单位等摩尔重复连接组成，HA分子中含有的大量的羧基和羟基可与水形成氢键而结合大量的水。电子显微镜下证实32透明质酸为线形单链，在水中扩展成随机的线圈状，直径约为500nm。透明质酸分子中每一双糖单位均含有一个羧基，在生理条件下可解离形成负离子，等空间负离子的相互排斥，使其分子在水溶液中处于松展状，占据大量空间，可结合多于本身1000倍的水]。故其亲水性强于壳聚糖。亲水角测量结果显示两种亲水性质的膜表面交替出现，提示组装过程中CS、HA交替组装成功。在涂层4个双分子层后，亲水角已经下降到50度以下，再增加涂层的层数并不能显著降低亲水角。为不影响滤器的透析性能，在提高其亲水性的同时应尽量减少涂层所引起的厚度增加，故只需涂层4个双分子层就足随着医学的发展，微创性的介入治疗已经应用于各临床学科。医用植入体及介入治疗的表面药物控释涂层可以形成长效、靶向的药物传递体系，局部的高浓度药物可以提高治疗的有效性，降低系统毒性。层层自组装涂层表面规整的层状水凝胶结构同时也为药物控释涂层提供了良好的手段33。Etienne0等研究了由透明质酸和壳聚糖组装的多层膜在各种酶及在生理环境条件下的降解特性。研究发现未经交联前，HA/CS多层膜在溶菌酶，淀粉酶存在条件下快速降解，而经过交联后多层膜的抗降解能力大大提高。在小鼠口腔中的体内降解实验发现，交联后的多层膜在3天后仍有60%的剩余。HuangLY等35采用分子自组装技术成功在支架表面实现了西罗莫司的缓释涂层，发现5层药物缓释涂层在体内最长释放时间就可以达到20天以上，而且西罗莫司的释放速度还可以通过分子自组装的层数来进行调控。目前，分子自组装构建多层膜用于装载和释放药物在血管支架表面修饰中已经较为成熟，然而在血液净化领域还鲜有报道。本实验通过CS和HA的静电层层自组装，将CS直接溶于AG溶液中，通过层层自组装实现了CS和HA对AG的装载。通过浸泡释放试验证明，AG确实已经成功装载于CS/HA双分子层中，并且经过长时间浸泡后可以释放出来。但是其释放出来所需要的时间太长。检测结果显示在浸泡15h后才会出现微量，而这个剂量完全不能达到其有效抗凝所需剂量36。AG缓释出现的时间过晚，与本实验设想有出入。这外由于浸泡液使用的是生理盐水，其中不含有能溶解CS、HA的酶，在浸泡过程中对双分子层的破坏较小，也可能导致AG缓释时间延长。第五章结论1壳聚糖/透明质酸静电自组装可以修饰聚砜膜，综合考虑其亲水性、通透性，4个双分子层为适宜层数。2壳聚糖/透明质酸静电自组装可以装载阿加曲班，并实现阿加曲班的缓慢[1].UchinoS,BellomoR,MorimatsuH,etal.ConfortheKidney(B.E.S.T.Kidney)Investigators.[J]Intensi[2].DecherG,HongJD,SchmittJ.Buildupofuself-assemblyprocess:IConsecutivelyalcationicpolyelectrol[3].GrothT,LendleinA.Layer-by-LayerdepositionofpolyelectrolytesAtoolfortheinvivorepairofbl[4].ThierryB,WinnikFM,TabrizianM,etal.Bioactivecoatstentsbasedoncules.2003.Nov-Dec;4(6):1564-71.[5].FareedJ,JeskeWP.Small-moleculedirectantithrombins:argResClinHaematol,2004,17(1):127-138.multilayeronthermoplasticpoltechnique.[J]JBiomedMaterResBApplBiomater.2007Oct;[7].YuDG,LinWC,YangMC.Surfacemodificationofpoly(membranevialayer-by-layerassemblyofsilvernanoparticle-embeddedpolyelectrolytemultilayer.[J]BioconjugChem.20[8].SwanSK,HurstingMJ.Thepharmacokineticsandpharmacodynamicsofargatroban:Effectsofage,gender,aPharmacotherapy,2000,20(3):318-329.[9].RicheyT,IwataH,OowakiH,etal.Surfacemodificationoballooncathetersforloc[10].CoxDS,KlePharmacodynamicsofArgatrobaninCombinationWithaPlateletGlycoproteinIIB/IIIAReceptorAntagoniIntervention[J].TheJournalofclinicalpharmacology,2004,44(9):981-99[11].KatasalaN,MissirlisYF.Comparisonofhaemocompatibilityimprovementof硕士学位论文参考文献fourpolymericbiornaterialsbytwohepar2003,24:677—688.[12].CHENCT,CHANGY,SUNGHW,etal.Efectsofheparinonthesurfacecharacteristicsofabiologicaltissuefixedwithaoccurringcrosslinkingagent(genipi)[13].GuanJJ,GaoCY,etal.Surfacephoto-graftingofpolyuretha2-hydroxyethylacrylatgrowth.[J]BiomateS[14].GuanJJ,GaoCY,etal.Functionalizingofpolyurethanephotograftingwithhydrophilicmonomers.[J[15].YoungChangNho,OhHyunKwon,ChenJ.IntroductionofpRadiationPhysicsandChemistry,2002,64:67-7[16].AkonH,KazunobuS,MasaharuH.ChemicfiberswithvinylpyrrolidonehavingimprovedbloodcompatiBiomaterials,2002,23:2659-2666.[17].HongY,GongYH,GaoCY,etal.Collagen-cochitosanhydrogelcomposite:InjectablescaffoldforcartilageregeneBiomedMaterRes,2008,85A:628-637.[18].SangHY,WatanabeJJ,IwasakiY,etal.Novelcellulblendedwithphospholipidpolymerforhemocompatiblefiltrationsystem[J].JMembrSci,2002,210:411-4[19].HasegawaT,IwasakiY,IshiharaK.Preparationofbloodcompatiblehollowfibersfrompolymeralloycomposedofpolysulfoneandphosphorylcholinepolymer[J].JBiomedMaterRes(ApplBiomater),2002,63:[20].徐良，景在平。国产真丝涤纶血管移植自然内皮化研究。[J]上海生物医学工程杂志，2000(2):19-20[21].MendelsonJ,BarrettC,ChanV,etal.Fabricationofmicreporeusthifrompolyelectrolytemultilayers.[J]Langmuir,2000,16:5017～5023[22].SullivanDM,Bruenpreparedfromlayeredpolyelectrelytes.[J]AmChemSOc,2001,123:11805~[23].YuDG,JouCH,LinWC,etal.Surfacemodifiadipate-co-terephthalate)membraneviadextransulfatepolyelectrolytemultiplayer.[J]ColloidsSurfB[24].YuDG,LinWC,LinCHetamultilayeronthermoplasticpolyurethanevialayer-by-technique.[J]JBiomedMaterResBApplBiomater[25].YuDGLinWC,YangMC.Surfacemodificationofpoly(L-lacmembranevialayer-by-layerassemblyofsilvernanoparticle-embeddedpolyelectrolytemultilayer.[J]Biocon[26].VavrikovaE,VinsovaJ.Chitosananreview.[J]VeterinarniMedicina,2008,53([28].TristanIC,Andreadepositionofhyaluronicacidandchitosano[29].ChiHJ,LingY,ShangML.etal.Biocompatibil2007,104(1):220-225.processofpolyelectrolytemuhiayers[J].Macromolecules,1998,31(3):[31].RichertL,LavalleP,PayanE,etal.Layerbylayerbuildupofpolysaccharidefilms:Physicalchemistryandcellularadhesionaspects.[J](2):448-458.[32].FesslerJH,FesslerLI.Electronmicroscopicvisualizationofthepolyharidehyaluronicacid[J]ProcNatlAcadSciUSA,1[33].MannaU,PatilS.EncapsulationofUnchargSubstanceinPolymericMembraneCapsulesvia[J]JournalofPhysicalChemistry,2008,112(42):13258-13262.stabilityatthesurfacesoforalprosthesisbasepolymers:aninvitroandistudy.[J]JDentRes.2006Jan;硕士学位论文参考文献[35].HuangLY,YangMC.Surfaceimmobilistents.[J]ColloidsandSurfacesB-Bioi[36].RobertW.Yeh;Ik-KyungJang.Argatroban:Update.[J]Americanheartjournal,2006,151(6):1131-1138.硕士学位论文近年来，血液净化治疗已经广泛应用于肾衰竭、多器官功能障碍综合症、急性胰腺炎、溶血尿毒综合症等危重疾病的治疗，2。血液净化治疗过程必然涉及到体外循环，由于管路、透析器等人工材料尚无法做到完全的生物相容，故凝血因子的激活无法避免。因此，抗凝是血液净化治疗进行的必要前提。而接受血液净化治疗的患者由于原发病的影响，很多存在一定凝血功能障碍，使抗凝方法的应用非常复杂。而到目前为此，国际上尚无统一的标准抗凝方案³。本文就目前应用于血液净化治疗的抗凝方法做一综述。1.常规全身肝素抗凝全身肝素抗凝仍然是目前最常用的抗凝方法。肝素是由葡萄糖胺和葡萄糖醛酸交联而成的粘多糖酯。普通肝素的分子量为0.3~3万Da,平均1.5万Da。半衰期0.5--2小时，平均50分钟。肝素的抗凝机制在于可与血浆中的抗凝血酶(AT)结合成复合物。AT是一种α球蛋白，是凝血酶的抑制物，对某些激活的凝血因子如XIIa、激肽释放酶、XIa、IXa、Xa和Xa均有抑制作用。在正常情况下AT起到抗凝的作用，肝素与AT结合后则大大加强了后者抑制凝血因子的作用。故肝素是通过凝血过程的多个环节而发挥作用，但其中以抑制Xa为主。但是肝素全身抗凝存在很多缺陷：其出血并发症高达4--30%@。会出现肝素诱导的血小板减少症，尽管发生率只有1--3%5。而且长期的应用肝素会加剧骨质疏松、引起骨营养不良6,7。另外若患者存在有凝血酶Ⅲ缺乏或者血管内凝血时，使用肝素不能获得满意的抗凝效果8。这些不足都严重限制了肝素抗凝在血液净化治疗中的应用。2.局部肝素抗凝最早用于代替全身肝素抗凝的方法是局部肝素抗凝，该方法是通过血路管道的动脉端输入肝素，使透析器及动脉、静脉肝素化，在血液回入患者体内之前，用硫酸鱼精蛋白中和肝素，其对全身的抗凝作用较轻微，以减少出血的危险。鱼精蛋白为小分子富含精氨酸的蛋白，呈弱碱性，可与富含酸性基因的肝素结合形成稳定的盐，使肝素失去抗凝活性。该方法简便，可以达到充分的体外抗凝，在我国也有临床成功应用的经历⁹。但是该方法可以出现肝素反跳，从而引起出血，出血多发生在透析结束后2-4小时1。对于一些活动性出血、血小板严重减少的病人，可以应用无肝素盐水冲洗法。该方法为先预冲，肝素盐水浸泡，冲洗，治疗时高血流量，严密监视静脉压、跨膜压，每15--30min用100—200ml生理盐水冲洗透析器一次。该方法要求高血流量，会增加容量负荷，而且频繁的冲洗会加剧病人的贫血。另外该方法操作烦琐，护理工作量太大。难以在临床推广。4.低分子肝素低分子肝素(LMWH)为普通肝素经酶解后纯化得到，分子量为4000～6000DDa。由于分子片断明显缩短，与凝血酶Ⅱa的亲和力下降，故抗凝作用(致出血)减弱，对凝血时间影响较小。同时与ATII的结合力增强可迅速灭活凝血因子Xa,从而保留了抗血栓活性"。低分子肝素是选择性作用于凝血因子Xa,而且半衰期较长，约2倍于普通肝素，且不易被血透清除。但因较少引起出血，适用于高危出血倾向的患者。但是低分子肝素没有理想的临床监测指标，其个体化剂量的调整比普通肝素困难。而且在有些病人，低分子肝素仍然可以引起透析相关性出血和其他并发症5.局部枸橼酸抗凝法钙是血液凝固必需的元素。枸橼酸又名柠檬酸，能够螯合血中钙离子生成难以解离的可溶性复合物枸橼酸钙，致使血中钙离子减少，阻止凝血酶原转化为凝血酶，从而达到抗凝作用。枸橼酸进人体内后，主要在肝脏、肌肉组织及肾皮质参加三羧酸循环，很快被代谢为碳酸氢根，而无任何残留。当停止输入枸橼酸半小时后，机体能将之完全代谢，使体内离子钙及枸橼酸根浓度恢复正常4。局部柠檬酸抗凝方法为：在体外循环动脉端输入一定浓度的枸橼酸钠溶液，以显著降低局部离子钙浓度，防止血液在透析器和血管管路凝血；当血液回输至体内后，通过补充足够的离子钙，使机体凝血功能保持正常。这样既可起到体外循环抗凝作用，又不至于影响体内凝血功能，从而减少出血并发症的发生率。局部柠檬酸抗凝的常用方法是将柠檬酸直接从动脉端输入或者将柠檬酸混入置换液中，也有报道将柠檬酸直接加入透析液中。目前国内外已经有大量的在血液净化治疗中成功应用局部柠檬酸抗凝的报道15,16.17。实验及临床应用表明：局部柠檬酸抗凝不仅可以达到充分抗凝的效果，还可以抑制多型核细胞及血小板的活化8,减少氧化还原反应8,改善生物相容性，并明显减少出血等并发症1⁹-21的发生率。另外还可以提高透析器清除率7,硕士学位论文延长透析器使用寿命22。枸橼酸钠抗凝主要并发症包括容量负荷过多、低钙血症前列环素具有抑制血小板聚集、粘附的作用，对体内凝血系统影响较小，半衰期仅2分钟，可用于高危出血倾向及肝素不耐受的透析患者3。但由于部分病人会出现血管扩张、剂量依赖性低血压、心动过缓等不良反应，且无中和制剂，限制了其在临床的应用。甲磺奈莫司他(FuT)是一种人工合成的小分子蛋白酶抑制剂，分子量仅为539Da,可抑制胰蛋白酶、凝血酶等，并具有抗血小板聚集的作用。其体内半衰期仅23分钟，对血脂无影响，且不易引起出血。现已在日本开始用于透析，相关凝血酶是一种丝氨酸蛋白酶，其具有促进纤维蛋白原血小板和抗纤维蛋白溶解作用。凝血酶有3个重要结构：1个活化中心，2个底物结合位点(分别结合纤维蛋白和肝素)。直接凝血酶抑制剂(directthrombininhibitor,DTI)是新兴的抗凝剂，它不仅能抑制凝血酶，也可抑制凝血酶介导的因子V、VⅢ、XⅢ,纤维蛋白原及血小板活性，且不会导致肝素诱导的血小板减少。此外它还具有抑制血小板聚集以及抗炎等作用。DTI分为单价DTI和二价DTI,拉加群、依非加群和伊诺加群等。二价DTI结合活化中心与底物结合位点，代表药物为水蛭素(地西卢定或重组水蛭素)及比伐卢定。目前通过美国食品药物管理局批准的DTI有水蛭素、比伐卢定、阿加曲班和地西卢定。而目前在血液净化治疗的抗凝中应用较多的有水蛭素、阿加曲班、美拉加群。直接凝血酶抑制剂中在血液净化治疗抗凝中运用最多的是水蛭素与重组水蛭素。水蛭素是从欧洲医用水蛭唾液腺提取的含有65个残基的肽类，它的抗凝作用不依赖于抗凝血酶IⅢ(ATIII),是一种具有高度选择性的凝血酶抑制剂。常常用于肝素诱导的血小板减少症患者以及ATII缺乏患者血液净化的抗凝26,27。但是由于水蛭素的半衰期在肾功能不全时显著延长28,故在应用水蛭素作为抗凝剂时，除了监测APTT外，还要检测血中r-水蛭素水平。阿加曲班是左旋精氨酸衍生物合成的DTI,相对分子质量527D,是一种小分子直接凝血酶抑制剂，与凝血酶的活性部位可逆结合。阿加曲班是一种快速起效的凝血酶抑制剂，能有效的抑制游离的以及血栓内的凝血酶，而不需要ATII的辅助29。与水蛭素不同的是，阿加曲班是在肝脏代谢，肾功能不全时其药代动力学和药效学没有明显的变化30。有报道证明肾功能不全时阿加曲班可以提供安全有效的体外抗凝31,32],而且并发症很少。鉴于阿加曲班以上特点，使其成为临床替代肝素抗凝治疗的最有潜力的药物。但是其昂贵的价格限制了其在临床上的广泛使用。美拉加群是一种分子量仅为430Da的新型直接凝血酶抑制剂，其在欧洲被运用于整形外科手术的抗血栓剂，用于血液净化中33的报道比较少，而且主要经肾脏代谢，肾功能受损时排泄受影响。这限制了其在血液净化治疗中的应用。透析膜做为一种非生物物质，与人体血管内皮始终存在差别，不可避免地会引起机体的异常反应。理想的生物相容性膜应与人体的血管内皮极为相近，应是无毒性、无抗原性，无补体、白细胞和单核细胞激活及细胞因子的释放，对凝血系统也没有影响。而为了改善透析膜的生物相容性，除了不断改善透析膜所用材料(由纤维素膜--改良纤维素膜--合成膜),近年来对透析膜表面修饰的研究也比较多。膜的表面性质决定了血液和膜之间相互作用的特性及程度，包括蛋白质的吸附、血栓症、补体激活和免疫反应等。膜表面的荷电性是膜表面性质、血液和透析膜之间相互作用的关键特性之一。透析膜的表面荷电性能对透析膜的溶质清除率、对补体激活作用和蛋白质吸附、血液凝固均有重大影响34,是理解血液和膜之间相互作用的基础。目前膜表面修饰抗凝中研究和应用最多的是血仿膜肝素吸附法。其原理是：临床所用的透析膜中血仿膜是唯一带正电荷的膜，其膜表面带有含正电荷的二已氨基乙基簇，而肝素为带二价阴离子的粘多糖硫酸酯的钠盐。血仿膜肝素吸附法正是利用正负电荷相吸的原理，使膜内带正电荷的二已氨基乙基簇接触带负电荷的溶液时，在血仿膜透析器内膜面形成有抗凝作用的肝素界面，达到局部良好的抗凝效果[35]。具体用法为：①透析前生理盐水1000ml冲洗透析器及动静脉管路后，排空含有残留消毒剂的预冲液；②肝素盐水50mg--100mg/500ml做闭管循环，血泵速100ml/min,吸附25--30min后排空肝素盐水；③再用生理盐水500ml冲洗吸均证明其是一种安全有效的抗凝方法。由于肝素只吸附于透析膜上，并没有进入体内，其引起出血并发症的概率很低，而且不会出现肝素诱导血小板减少、骨质凝方法。但是也有报道，认为其存在少数病人不能充分抗凝、透析过程需要密切监控、缺乏循证医学证据等缺点，对其应用持保守态度39。近年来亦有使用低分子肝素对透析器以及透析管路进行表面修饰而成功抗凝的报道4。肝素吸附法仅仅利用了血仿膜表面的正电荷与带负电荷的肝素结合，并没有改变膜表面的荷电性，且仅仅应用于血仿膜。近年来，有人开始尝试改变透析膜的表面荷电性。AN69聚丙烯腈膜表面带负电荷，SylvieLavaud⁴1等运用聚乙烯亚胺压条法中和其表面负电荷，继而与带负电荷的肝素牢固结合，并成功应用于羊的血液透析。Wen-ChingLin(42等将壳聚糖与肝素形成聚合电解质络合物，再共价固定于聚丙烯腈膜表面。实验结果表面，修饰后的聚丙烯腈膜亲水性增加，的是，经过修饰后的聚丙烯腈膜能够抑制绿脓杆菌的活性。尽管这些方法还没有实现临床应用，但是为我们探索膜修饰抗凝指出了一条新的道路。最近有人应用层层自组装技术(layer-by-layerself-assemblytechnique)进行膜的表面修饰。层层自组装技术是基于聚电解质阴阳离子所带正负电荷间相互作用的一种自组装超分子技术。该技术的主要特点是在表面荷电的基材表面通过静电相互作用交替地吸附上带相反电荷的聚电解质阴阳离子。因此，它具有一系列优点，如：组装分子的选择范围广泛，可以为合成的聚电解质，也可以是蛋白质、多糖、DNA等荷电的生物活性大分子；其制备工艺简单，通过简单的交替浸涂技术可实现在材料表面组装分子在纳米、亚微米尺度的有规结构设计；制备条件温和，可在常温水溶液中进行，可以保证生物分子具有维持生物活性的天然构像；此外，该方法适用的基体材料种类多，对基体材料的体型结构适应性强，并可在具有复杂体型结构的装置和材料上实现。具体方法为：壳聚糖(作为正电荷层及抗菌剂)和硫酸右旋糖苷(作为负电荷层及抗黏附剂)组成聚合电解质层，然后应用叠层自组装技术对膜进行表面修饰。研究43,4.45证明：经过四个双层装载后(硫酸右旋糖苷层与血液接触),接触角以及膜zeta电位达到一个稳定值。经过修饰后，膜的亲水性、生物相容性可大大提高。与血液接触的右旋糖苷层可以抑制血小板黏附和血浆纤维蛋白原吸附，明显延长凝血时间。另外经过修饰的膜还具有一定的抗菌能力。GuillermoA.Ameer等46在1999年发明了一种设备，肝素酶I以一种特殊的方式固定于其中。肝素酶I能特异性的将肝素降解为碎片并灭活其抗凝活性。局部肝素法抗凝时，将肝素从动脉端注入，而将该设备安装于静脉端，在血液进入体内前将肝素完全清除。该方法可以达到充分的体外抗凝，而无鱼精蛋白引起的反跳出血、低血压等并发症。该方法已经成功的应用于羊的血液净化14,但不知为何一直无临床应用的报道。抗凝是血液净化治疗得以进行顺利进行的关键，而选择何种抗凝方法需要根据患者的具体情况以及本单位的条件进行综合评价，个体化选择对患者最有利的抗凝方法。ICU:fromrenalreplacementtherapy(RRT)tomultipleorgansupporttherapy(MOST).[J]IntJArtOrg,2002,25(8):733-747.[2].孙玉汾，容永璋.连续性血液滤过治疗多器官功能障碍综合征临床分析[J][3].UchinoS,BellomoR,MorimatsuH,etal.Continuousrenalreplhaemofiltrationonoutcomesofacuterenaltrial.[J]Lancet2000;356:26-30[5].HenriquezF,Rodrihemodialysis.Casereportandreviewoftheliterature.[J]Nefrologia.2006;26(6):734-7.[6].LaiKN,HoK,CheungRCKetabonemetabolismandhyperlipidemiainpatientsonmaintenancehemodialysis.[J]IntJArtifOrgans20[7].TaalMW,MasudT,GreenD,Cdensityinhaemodialys[9].樊桂娟.局部肝素抗凝在高危出血倾向患者行血液透析中的应用及护理[J]中国临床护理杂志2006.5(6):13-15[10].FealyN,BaldwinI,JohnstoneM,controlledcrossoverstudycomparingregionalheparinizationtoregionalcitanticoagulationforcontinuousvenovenoushemofiltration.[[11].DavenportA.Low-molecular-weightheparinforroutin[12].GrzegorzewskaAE,Młotantiplateletdrugs,andbonemineraldensityindialysis[13].BerniehB,BoobesY,AlHakimMR,Long-TermUseofLow-Molecular-WeightHeparininHemodialysisPatients:A7-YearExperience.[J]BloodPurif.2009Feb4;27(3):