《金银花抑菌成分抑菌性研究》4700字【论文】

金银花抑菌成分抑菌性研究目录TOC\o"1-2"\h\u13442金银花抑菌成分抑菌性研究 030064引言 15031.材料与方法 2266501.1主要材料与仪器 2259791.1.1材料 295201.1.2实验药品 2104891.1.3培养基 2219071.1.4实验仪器 2260661.2实验内容 377232.结果与分析 5116512.1实验结果 5102762.1.4石榴皮多酚对金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度（MIC）的测定结果分析 7168202.2结论 73678参考文献 8摘要：金银花因其退热降火等功效被人们熟知，金银花常被用于泡水饮用，其价格低廉作用广泛口味独特深受大众喜爱。许多植物中都含有多酚，金银花中的有效成分多酚物质具有抑菌性，可以作为抑菌消炎的药物作用于人体，本文利用水提法、乙醇提取法来提取出金银花中多酚物质，比较二者多酚的率的高低，实验证明水提法多酚得率为1.05%，乙醇提取出多酚得率为2.17%，发现乙醇提取的多酚得率更高；用牛津杯法检测金银花提取液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、粘质沙雷氏菌的抑制作用；用红四氮唑法在96孔板中得出金银花多酚物质对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC)为30mg/ml。从金银花中提取的抑菌成分可有效的抑制多种有害菌的活性，可作为天然药物、食品添加剂等开发使用。关键词：金银花；多酚物质；提取；抑菌引言金银花为忍冬科植物忍冬的干燥花蕾，又称双花、金花、银花[1]，因为忍冬花初期是白色，经过一段时间后转为黄色，故命名为金银花，我国金银花栽培历史悠久，花、叶、茎都能作为药材使用[2]。金银花有清热解毒的功能，它能退热清火、消炎止痛,却没有胃肠道的副反应，享有“药铺小神仙”之誉，深受医患的欢迎[3]。金银花在2012年就被原国家卫生和计划生育委员会批准作为药食同源食品原料[4]，是一种对人类健康有极大益处的植物。研究表明金银花有广谱抗菌作用对多种致病菌都有抑制作用，其中对金黄色葡萄球菌的抑菌和杀菌作用最为明显[5]，防治细菌类疾病通常使用的是抗生素，但是抗生素的广泛使用会使细菌具有抗性，为以后的治疗带来难度，由于中草药具有广泛来源、不宜生产耐药性且毒副作用较小的特点，因此受到广泛关注[6]。另一方面金银花中含有丰富的多酚、有机酸、黄酮类等成分，随着当前我国动物食品安全性的提高，金银花以其纯天然、无残留、毒性小，兼具营养与药用的特性而被养殖业高度重视[7]。金银花来源广泛，原料容易取得，加工成本低，在未来医药和临床治疗上将会起到重要作用。本研究主要研究金银花多酚的两种提取方法和金银花多酚对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、粘质沙雷氏菌的抑制作用，为临床医药和新型植物源食品防腐剂提供理论依据，对有效利用金银花，拓宽金银花利用途径有重要意义。1.材料与方法1.1主要材料与仪器1.1.1材料金银花购于中药材店，置于烘箱于40℃烘干后，粉碎机打碎烘干后的金银花呈粉末状，过筛保存。大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、粘质沙雷氏菌的菌种均为实验室保存。1.1.2实验药品无水乙醇、福林酚、无水碳酸钠、没食子酸标准品、胰蛋白胨、氯化钠、牛肉膏、琼脂粉、磷酸缓冲液（PBS），红四氮唑（TTC）均为化学纯。1.1.3培养基制作牛肉膏蛋白胨培养基，称取蛋白胨5g、牛肉膏1.5g、氯化钠2.5g、琼脂10g溶于500ml蒸馏水中，用氢氧化钠溶液调pH至7.2左右，灭菌备用。1.1.4实验仪器DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌水浴锅（力辰科技有限公司）、DHG-9101.0A型电热恒温鼓风干燥箱（上海三发科学仪器有限公司）、722型分光光度计（上海仪电）、TGL-16型高速离心机(金坛市新锐科技)、FA1104型电子天平（上海越平科学仪器有限公司、SHP-25生化培养箱(上海三发科学仪器有限公司)、BBS-SDC-A超净工作台(博科生物公司)1.2实验内容1.2.1多酚含量的测定溶剂提取法是根据天然产物中各种化学成分在溶剂中的溶解性质,将有效成分从金银花组织中溶解出来的方法,溶剂可分为水、亲水性有机溶剂和亲油性有机溶剂[8]。本文以蒸馏水和乙醇溶剂为代表，研究溶剂为水、有机溶剂时，哪种方法金银花中多酚提取率较高。1.2.1.1标准曲线的制作用没食子酸做标准曲线，采用福林(Folin)-酚比色法来测定金银花提取液多酚含量，用称量纸称取0.10g没食子酸粉末，加入适量蒸馏水溶于烧杯中，转移至100ml容量瓶中进行定容。再分别取0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10ml的没食子酸溶液于100ml容量瓶，再分别定容至100ml，制成不同浓度梯度的没食子酸溶液备用，同时配制40%的福林酚试剂和7.5%的Na2CO3溶液。分别取不同浓度梯度的没食子酸溶液1ml于试管中，各加入5ml的蒸馏水和1ml的40%福林酚试剂，反应3min后加入3ml的7.5%的Na2CO3溶液混合均匀，室温反应60min后在765nm的分光光度计中测出不同浓度梯度的OD值，作出标准曲线。1.2.1.2水提法将金银花干燥打碎的粉末打碎备用。分别精确称取三份1g的金银花粉末分别置于三个锥形瓶中，编号1、2、3，每个锥形瓶中分别加入30ml蒸馏水和转子，放于DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌水浴锅中，封上保鲜膜并戳几个小洞，防止加热过程中水分挥发。在60℃条件下水浴加热提取120min。将提取完全的试剂置于离心管中，离心20min，转速为4000r/min，上清液即为金银花中的多酚提取液。分别取出0.5ml多酚提取液，各加入49.5ml蒸馏水，将多酚提取液的原液稀释100倍，取稀释后的多酚提取液于试管中，编号1、2、3，分别加入1ml的40%的福林酚试剂，5ml的蒸馏水，3min后加入3ml的7.5%的碳酸钠溶液并将制备好的反应液置于室温反应60min后在最大吸收波长765nm处测出OD值。1.2.1.3乙醇提取法分别精确称取三份1g的金银花粉末分别置于三个锥形瓶中，每个锥形瓶中分别加入30ml的60%浓度的乙醇溶液和转子，放于DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌水浴锅中，封上保鲜膜防止乙醇蒸发。在60℃的条件下水浴加热提取120min。将提取完全的试剂置于离心管中，离心20min，转速为4000r/min，将上清液取出置于烧杯中，并敞口放置在80℃的水浴锅中加热30min，此时上清液无酒精味，含量浓缩至原液的大约三分之一处。分别取出0.5ml多酚提取液，稀释100倍，取稀释后的多酚提取液于试管中，编号1、2、3，分别加入40%的福林酚试剂1ml，5ml的蒸馏水，3min后加入3ml的7.5%的Na2CO3溶液并将制备好的反应液置于室温反应60min后在最大吸收波长765nm处测出OD值。1.2.2金银花多酚对细菌的抑菌性1.2.2.1细菌的培养准备好大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、粘质沙雷氏菌的斜面。在无菌操作台中倒平板，在培养基完全凝固后，用接种环挑取少许菌种在牛肉膏蛋白胨平板上划平板，划好的平板标记好放在37℃培养箱中培养24h。1.2.2.2细菌的活化提前将液体培养基，牙签，镊子，在灭菌锅中进行灭菌处理后在烘干箱中保存。在无菌操作台中将镊子在酒精灯上过火灼烧后拿牙签在平板内挑取各菌种的单菌落，将牙签放入液体培养基内，塞上棉塞后将做好的液体培养基放入恒温振荡箱内进行振荡培养，温度为37℃，时间为24h。注意全程靠近酒精灯操作防止杂菌进入培养基影响结果。24h后观察到液体培养基变浑浊，有菌生长。1.2.2.3抑菌性实验步骤提前打开超净台进行灭菌处理15min，将提前配置好的牛肉膏蛋白胨培养基融化，室温冷却至不烫手后在无菌操作台中倒平板，待培养基完全凝固后加入300μl菌液到培养基上进行涂布，将涂布好的培养基放置1—2min后用在酒精灯上灼烧过的镊子夹住牛津杯小心的放在培养基上，注意牛津杯底部要与培养基紧密接触防止后续添加的液体漏出，每个培养基放两个，两个牛津杯左右对称放置，在A位置的牛津杯中加入200μl无菌水，B位置的牛津杯加入200μl的多酚提取液，放置37℃培养箱24h后拿出培养皿，用吸水纸小心地吸取出牛津杯中残存的液体，取出牛津杯后检查抑菌圈大小。1.2.3金银花多酚对金黄色葡萄杆菌最小抑菌浓度(MIC)的测定将乙醇提取法提取的多酚提取液调整浓度为0、10、20、30、40、60、80、100、200mg/ml。准备好之前悬浮培养的金黄色葡萄球菌液。无菌操作台中，在96孔板上使用枪头分别加入100μl

的上述九个不同浓度的多酚提取液，做两组对照组。在96孔板上使用枪头在孔中分别加入100μl的金黄色葡萄球菌菌液后加入100μl的红四氮唑溶液。盖上孔板放入37℃保温箱培养24h后观察现象。2.结果与分析2.1实验结果2.1.1没食子酸标准曲线的制作发现浓度在0~0.06mg/ml时呈良好的线性关系，根据浓度和OD值得出没食子酸标准曲线，由图1得出标准曲线误差为0.9963，大于0.99，该方程式可以作为标准曲线的方程式。图1没食子酸标准曲线图2.1.2多酚提取结果根据三组测出的吸光度值算出平均值，再根据公式多酚提取率＝(提取液浓度×稀释倍数×体积)/质量×100%可以算出水提法的多酚提取率为1.05%，乙醇提取法的多份提取率为2.17%。比较二者得出乙醇为代表的溶剂提取法提取率大于蒸馏水提取的，后续实验均用乙醇提取法提取出的提取液。2.1.3金银花多酚对不同菌种抑菌性结果图2金银花多酚对细菌的抑菌性图（注：A—铜绿假单胞菌、B—粘质沙雷氏菌、C—大肠杆菌、D—金黄色葡萄球菌、E—枯草芽孢杆菌）表1金银花多酚对细菌的抑菌圈（单位：mm）菌种金黄色大肠杆菌大肠杆菌铜绿假单胞菌粘质沙雷氏菌枯草芽孢杆菌抑菌圈大小（单位：mm）14.612.37.88.511.42.1.4石榴皮多酚对金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度（MIC）的测定结果分析（注：各孔对应提取液浓度为a—0mg/ml、B—10mg/ml、C—20mg/ml、D—30mg/ml、E—40mg/ml、f—60mg/ml、g—80mg/ml、h—100mg/ml、i—200mg/ml）（TTC）TTC赵英妹等人研究证明金银花对金黄色葡萄球菌的MIC为30~125mg/ml[9]的结果相一致。2.2结论金银花中的多酚物质可以抑菌消炎，药用成分很高。本文使用水提法、乙醇提取法提取金银花多酚成分，实验证明乙醇提取法的多份提取率更高，为2.17%。>大肠杆菌＞>粘质沙雷氏菌＞铜绿假单胞菌。由此可知，金银花的确对多种细菌都有明显的抑菌效果，特别是金黄色葡萄球菌与大肠杆菌，这两种是导致人腹泻的主要病原菌，所以通过喝金银花茶、吃含有金银花的药可以有效缓解腹泻的症状[6]，相关学者通过比对金银花提取物与传统抑菌药物,例如氟苯尼考、阿莫西林等药物,依据效果进行客观比对,分析数据显示金银花提取物的抑菌效果更好，且用药更稳定安全[11]。通过红四氮唑显色反应实验的反应结果，第四个孔中的TTC被还原成红色，说明开始抑菌，对应第四个孔中的金银花提取液的多酚浓度分析出金银花多酚对金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度为30mg/ml参考文献[1]赵德贵.清热解毒金银花[J].开卷有益-求医问药,2020(07):40-41.[2]李建军,李军芳,贾国伦.金银花研究进展概述[J].生物学教学,2012,37(06):2-4.[3]王海亭.清热解毒金银花[J].家庭医学,2019(11):52-53.[4]王琳,李宇轩,范维,等.金银花提取物对冷却肉中假单胞菌黏附性的影响[J].肉类研究,2020,34(02):20-26.[5]胡璇,李卫东,贾翎,等.四倍体金银花药材体外抗菌抗病毒实验研究[J].中国现代中药,2015,17(11):1160-1163+1170.[6]许钦坤,赵翠燕.金银花提取