病毒的分类及微生物检验

病毒分类

一、分类标准

核酸性质与结构病毒大小与形态衣壳对称性和壳粒数目有没有包膜对理化原因敏感性抗原性生物学特征（繁殖方式、宿主范围、传输路径和致病性）1/18二、病毒分类系统和命名（一）病毒分类普通系统病毒分类系统将病毒分类为科(families)、属(genera)、种(species)等三级，或科、亚科、属、种等四级。依据病毒体形态、基因结构和复制模式等特征将病毒分为科和亚科；在科或亚科中又依据理化特征和血清学特性等分病毒属，属名后缀为—virus，属下分为不一样病毒种。2/18分类

可将病毒分为科、亚科和属

惯用核酸类型分类1DNAvirus(DNA病毒中有9科)2RNAvirus(ssRNA－7科.ssRNA＋7科.dsRNA2科)3反转录病毒(DNA和RNA反转录病毒中有2科)

依传输方式和感染部位分类1虫媒病毒2肠道病毒3呼吸道病毒4肝炎病毒5性传输病毒（二）非寻常病毒分类1卫星病毒（satellites）2类病毒（viroids）3朊粒（prion）3/18

第三节

病毒学诊疗

本身免疫病和肿瘤亲密相关。病毒性疾病在人类疾病中占有十分主要地位。

因为病毒感染防治标准不一样于细菌等其它微生物，尽早判定病人感染或某传染病流行是由病毒所致，是医生和微生物学试验室责任和任务。

病毒分离与判定当然是病毒病原学诊疗金标准，但因病毒是严格细胞内寄生，病毒分离必须

有活细胞支持，故病毒分离判定较困难。4/18

一、标本采集、运输和处理1.应在感染早期（发病1～2天内）采集。2.必须无菌操作，对用于病毒分离培养污染标本用高浓度抗生素处理过夜，必要时需加抗真菌药品等3.及时送检，送检组织等可放入含有抗生素50%甘油缓冲盐水或二甲基亚砜中低温冷藏。4.血清学检验标本，尤其检测抗病原体IgG型抗体，应分别在发病早期和恢复期采集双份血清，只有当恢复期血清抗体效价比早期升高4倍或以上，才含有确诊意义。5/18分离培养判定(污染标本用抗生素处理过夜)快速诊疗鸡胚红细胞凝集试验红细胞凝集抑制试验细胞培养CPE电镜检测中和试验TCID50pfu测定MOI测定动物接种观察发病情况中和试验免疫学检测ID50测定LD50测定形态学电镜观察病毒颗粒（大小、形态）光学显微镜观察包涵体抗原检测ELISAIFRIAWB核酸检测核酸电泳核酸杂交PCR基因芯片基因测序抗体检测ELISARIAIFWB病毒成份检测

标本采集

6/18二、病毒分离与判定

以下情况需考虑进行病毒分离与判定：

1.病程长且诊疗困难病人。

2.怀疑为新现病毒（emergentvirus）感染或已被毁灭

病毒性疾病怀疑“死灰复燃”。

3.为判别临床上含有相同症状疾病。

4.监测所用减毒活疫苗。

5.用于病毒生物学性状研究或流行病学调查等。

7/18（一）病毒分离培养

1．细胞培养：原代培养细胞、二倍体细胞株、传代细胞

系或株

标本接种后溶细胞型感染病毒可致细胞出现细胞病毒

效应（CPE），稳定感染病毒细胞并不出现显著病变，但被感染细胞膜表面会表示病毒蛋白等标志物，如血凝素、神经氨酸酶、病毒特异性抗原等。

2．鸡胚培养和动物接种：

流感病毒分离培养虽可用犬肾传代细胞（MDCK）,

但鸡胚接种仍是最惯用敏感而特异方法。

动物接种是最原始分离病毒方法，但当前少用。8/18（二）病毒判定

1．病毒在培养细胞中增殖判定指标

（1）细胞病变（cytopathiceffect,CPE

）

大多数病毒属溶细胞型感染，在敏感细胞内增殖会出现CPE。CPE表现为细胞内颗粒增多、圆缩、聚集、融合，有可形成包涵体，出现细胞溶解、脱落、死亡等。

不一样病毒CPE特征不一样。所以，观察病毒所致

CPE特点，依据细胞类型，细胞病变种类可对标本中感染病毒进行判定。9/18脊髓灰质炎病毒感染所致CPEa.未感染vero细胞（一个非洲绿猴肾细胞系）b.脊髓灰质炎病毒感染vero细胞（显示细胞圆缩、分散、坏死、脱落）。

10/18（2）红细胞吸附（hemadsorption）

包膜上带有血凝素病毒感染敏感细胞后，血凝素会出现于细胞膜表面，使感染细胞能与加入红细胞结合出现红细胞吸附现象，这是检测正粘病毒和副粘病毒间接指标。

（3）中和试验（neutralizationtest,NT）

用抗某病毒血清先与待测病毒悬液混合，经作用一定时间后接种敏感细胞，培养后观察CPE或红细胞吸附现是否消失，即特异性抗体是否能中和对应病毒感染。如用不一样浓度抗血清进行中和试验，还可依据抗体效价对待测病毒液进行半定量检测。11/18

（1）空斑形成试验（plaqueformation）

（2）50%组织细胞感染量

（3）感染复数

（Multiplicityofinfection,MOI）

2．病毒感染性测定及病毒数量测定

12/18三、病毒感染快速诊疗

病毒分离与判定是病毒诊疗金标准，但临床试验室应用困难，而且费时，对临床病毒感染症诊治帮助不大。快速诊疗主要指临床标本绕过分离培养复杂而较长过程，直接在电镜下观察病毒颗粒，或直接检测标本中病毒成份和IgM抗体等，以作出快速和早期诊疗。13/18

（一）形态学检验

1．电镜和免疫电镜检验

含有高浓度病毒颗粒（≥107颗粒/ml）样品，可直接应用电镜技术观察。对含低浓度病毒样本可用免疫电镜技术，或用超速离心机将标本离心进行电镜观察，以提升检出率和特异性。电镜下不但能观察病毒形态学特征，还可测量病毒大小。

2．光学显微镜检验

病理标本或含有脱落细胞及针吸细胞标本检测病毒包涵体。包涵体对病毒诊疗有一定价值。观察病毒CPE。病理标本依据病理特征，再配合组化染色技术进行诊疗。

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（二）病毒蛋白抗原检测

1.酶联免疫技术（ELISA）

2.免疫荧光标识技术（IF）

3.放射免疫标识（SPRIA）

这些技术操作简便、特异性强、敏感性高。尤其使用单克隆抗体标识技术可测到ng（10-9g）至pg（10-12g）水平抗原或半抗原。其中因为放射性核酸可引发放射性污染，已逐步被非放射性标识物（如地高辛等）所代替。

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（三）早期抗体检测1．IgM型特异抗体检测检测病毒感染机体产生特异性IgM，如孕妇羊水中查到IgM型特异抗体可早期诊疗一些病毒引发胎儿先天性感染；IgM抗体测定有利于早期诊疗，但感染机体产生IgM抗体有显著个体差异。2．免疫印迹试验（Westernblot,WB）一些病毒感染诊疗需持慎重认真作法。如AIDS和成人白血病等，在初筛试验阳性后，尚需用WB法进行确认试验。16/18（四）检测病毒核酸

1．核酸电泳：正粘病毒属和呼肠病毒属核酸是分节段

，甲型流感病毒8个节段，轮状病毒11个节段。从

标本中直接提取轮状病毒核酸，经聚丙烯酰胺凝胶

电泳（PAGE）和银染色后在凝胶板上清楚核酸条

带，结合临床情况可进行诊疗。

2．核酸杂交：其原理是应用已知序列核酸单链作为探

针（probe），探针预先用放射性核素（32P或131I）或

生物素、地高辛苷原、辣根过氧化物酶等标识，在一

定条件下按碱基互补规律与标本

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