（高清版）DB12∕T 839-2018 茄子种子纯度SSR分子标记鉴定方法　

茄子种子纯度SSR分子标记鉴定方法2018-11-07发布天津市市场和质量监督管理委员会发布I本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由天津市农村工作委员会提出并归口。本标准起草单位：天津市农业质量标准与检测技术研究所、天津市蔬菜研究中心、黑龙江省农业科学院农产品质量安全研究所。本标准主要起草人：兰青阔、王利英、赵新、王成、兰璞、乔军、刘婧、陈锐、关海涛、张耀中、焦贺敏。1准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本标准。GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样由几个核苷酸(1～6个)为重复单位聚集而成的长达几十个至几百个bp(一般为100～200)的串联2微量加样器；磁力搅拌器；台式离心机；紫外-可见成像系统；胶片观察灯；水平摇床；高压灭菌锅；乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2);三羟甲基氨基甲烷(Tris);盐酸(HCl,36%);十二烷基硫酸双丙烯酰胺；丙烯酰胺；尿素；亲和硅烷；剥离硅烷；无水乙冰醋酸；硝酸银；甲醛溶液(37%);TaqDNA聚合酶(含Mg²的10×PCR缓冲液);四种脱氧核糖核苷酸 覆盖一层纱布，置于光照培养箱中。培养条件为16h35℃光照培养，8h28℃暗培养，待种子长出子叶到65℃,每管放入400μL混合样品，将离心管置于65℃金属浴或水浴锅中，保温30min后取下，向3用15对核心引物进行PCR反应，扩增双亲及送检样品各10份DNA,筛选带型清晰，双亲间差异大，互补性好的引物作为纯度鉴定的SSR分子标记。6.4PCR扩增6.4.1反应体系总体积10μL,包括5μL超纯水、1μL含Mg²⁴的10×PCR缓冲液、0.8μLdNTPs(2.5mmol/L)、0.6μLSSR引物(10μmol/L)、1μLTaqDNA聚合酶(2.5U/μL)、1μLDNA(30～50ng/μL),混匀。6.4.2反应程序94℃预变性5min;94℃变性1min,55℃退火30s,72℃延伸1min,循环35次；72℃延伸10min;-20℃保存备用。6.5变性聚丙烯酰氨凝胶电泳按照附录C规定的方法，进行4.5%变性聚丙烯酰胺凝胶制作及电泳检测扩增产物。7纯度计算以筛选出来的SSR分子标记为引物扩增送检样品的DNA,通过带型统计，用具有本品种特异带型的种子粒数占检测样品种子粒数的百分率表示纯度，计算公式如下：4(规范性附录)溶液配制A.1DNA提取液含有200mmol/LTris-HC1(pH8.0),250mmol/LNaCl,25mmol/LEDTA,0.5%SDS,经高压蒸汽灭菌后使用。A.2引物稀释按照引物合成单的说明先配制100μmol/L的储存液，取适量储存液稀释40倍，配制浓度为2.5mmol/L的使用液。A.36×变性上样缓冲液去离子甲酰胺49mL,0.5mol/L的EDTA溶液(pH8.0)1mL,溴酚蓝0.125g,二甲苯青0.125g。A.410×电泳缓冲液Tris108g,硼酸55g,0.5mol/LEDTA(pH8.0)溶液37mL,定容至1000mL。A.540%丙烯胺胶丙烯酰胺190g,甲叉双丙烯酰胺10g,定容至500mL。A.6A.64.5%丙烯胺胶尿素450g,10×电泳缓冲液100mL,40%丙烯酰胺胶112.5mL,定容至1000mL。20μL亲和硅烷，20μL冰醋酸，加无水乙醇至2mL。现用现配。A.82%剥离硅烷0.1g过硫酸铵溶于1mL超纯水中。现用现配。5A.10固定液200mL冰醋酸，定容至2000mL。A.11染色液4g硝酸银，定容至2000mL。A.12显影液2000mL蒸馏水中加入40g氢氧化钠和10mL甲醛。6(规范性附录)15对核心引物15对核心引物见表B.1。表B.115对核心引物表序号引物引物序列(5'-3')退火温度℃1F:GGATCAACTGAAGAGCTGR:CAGAGCTTCAATGTTCC2F:ACGTCTCATCCGAAATATAAR:GTTTGATAAGAAGGGCAAG3F:ACAAGACGAAAGTGTGCAR:GTTTGAAAGTGAAGAGTCC4F:ATGTTCTTCCCTTTTTCCR:GTTTCCAAGAAAGAAGAAA5F:ATCAAGATGAACAAGACTAAGR:GTTTCTTCAACCTGTCT6F:ATCATTGCCGTATCAGGTR:GTTTGGGAAAGTTGAGAATTT7F:ACAGGCATCACAAAGCAT8F:ACAACATTTCTAAGGGCCR:GTTTGGGCATATTTGGCACTT9F:ATTTACTATGCTACTTCACAR:GTTTACTGATCGCAGGAAAF:ATGTGTGAACTCAAATGGR:GTTTCGAATTGCTTTTTGGTGF:ATTGGTGAACGATGATCCR:GTTTAGAGAATGGGATGAGATF:ATTGACGGTGGAAAAGGAR:GTTTGGCGGCTTGATGATTTAF:ATCAAATGGGAGAAAATACR:GTTTGGCTTAAACACACAACGTAF:ACCTTACGCAATTTACACR:GTTTCAATGGCGTCACCTCF:AGTGCATTTCTCAAATCAR:GTTTCAATTTCACAGGCTCC7胶80mL,加入TEMED80μL和10%过硫酸铵400μL,迅速混匀后灌胶。灌胶过程中防止气泡产生。灌在20μLPCR产物中加入4μL6×变性上样缓冲液，混匀后，在PCR仪上运行变性程序：95℃变性5min,4℃冷却10min。用洗耳球吹洗加样槽，清除气泡和杂质。每个加样孔加入5μL变性后的PCR产物。80W恒功率电泳至上部的指示带(二甲苯青)到达