慢病毒包装操作方案

慢病毒包装操作方案一、引言慢病毒载体是一种高效的基因传递工具，在基因治疗、细胞生物学研究等领域具有广泛应用。本操作方案旨在详细介绍慢病毒包装的实验流程，确保实验人员能够准确、规范地进行慢病毒包装操作，获得高质量的慢病毒颗粒。

二、实验准备（一）实验材料1.细胞系：用于包装慢病毒的细胞系，如293T细胞等，应选择生长状态良好、无污染的细胞。2.载体质粒：包含目的基因的慢病毒载体质粒、包装质粒（如psPAX2）和包膜质粒（如pMD2.G）。3.试剂：DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素链霉素溶液、磷酸钙转染试剂、氯喹、聚乙二醇（PEG）8000、甘油、PBS缓冲液等。4.仪器设备：细胞培养箱、超净工作台、离心机、移液器、PCR仪、凝胶成像系统、倒置显微镜等。

（二）溶液配制1.DMEM完全培养基：在DMEM培养基中加入10%胎牛血清、1%青霉素链霉素溶液。2.0.25%胰蛋白酶EDTA溶液：称取0.25g胰蛋白酶和0.02gEDTA，加入100mlPBS缓冲液，过滤除菌后保存于4℃。3.2×HBS溶液：称取1.6gNaCl、0.074gKCl、0.37gNa₂HPO₄·2H₂O、1g葡萄糖，加入80ml双蒸水溶解，用1MHCl调节pH至7.12，定容至100ml，过滤除菌后保存于4℃。4.磷酸钙转染试剂溶液：称取2.5mg磷酸钙，加入1ml双蒸水，涡旋振荡使其溶解，逐滴加入2MCaCl₂溶液至1.25ml，边加边涡旋，室温放置30分钟后使用。

三、细胞培养（一）293T细胞复苏1.从液氮中取出冻存的293T细胞，迅速放入37℃水浴中，轻轻晃动使其快速融化。2.将细胞悬液转移至无菌离心管中，加入5mlDMEM完全培养基，轻轻吹打均匀。3.1000rpm离心5分钟，弃上清。4.用适量DMEM完全培养基重悬细胞，接种于T25细胞培养瓶中，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养。

（二）细胞传代1.当293T细胞密度达到80%90%时，进行传代。2.吸弃培养瓶中的培养基，用PBS缓冲液洗涤细胞12次。3.加入适量0.25%胰蛋白酶EDTA溶液，覆盖细胞表面，置于37℃培养箱中消化12分钟，待细胞变圆后，加入DMEM完全培养基终止消化。4.用移液器轻轻吹打细胞，使其分散成单细胞悬液，将细胞悬液转移至无菌离心管中。5.1000rpm离心5分钟，弃上清。6.用适量DMEM完全培养基重悬细胞，按照1:31:5的比例接种于新的细胞培养瓶中，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养。

（三）细胞冻存1.当293T细胞密度达到80%90%时，进行冻存。2.吸弃培养瓶中的培养基，用PBS缓冲液洗涤细胞12次。3.加入适量0.25%胰蛋白酶EDTA溶液，覆盖细胞表面，置于37℃培养箱中消化12分钟，待细胞变圆后，加入DMEM完全培养基终止消化。4.用移液器轻轻吹打细胞，使其分散成单细胞悬液，将细胞悬液转移至无菌离心管中。5.1000rpm离心5分钟，弃上清。6.用细胞冻存液（90%胎牛血清+10%DMSO）重悬细胞，调整细胞浓度至1×10⁶1×10⁷个/ml。7.将细胞悬液分装至冻存管中，每管1ml，置于程序降温盒中，先于80℃冰箱过夜，然后转移至液氮中保存。

四、慢病毒包装（一）转染前准备1.转染前一天，将293T细胞接种于6孔板中，每孔接种密度为2×10⁵个细胞，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养，待细胞密度达到60%70%时进行转染。2.计算所需的载体质粒、包装质粒和包膜质粒的用量，按照一定比例混合（如目的基因载体质粒:psPAX2:pMD2.G=2:1.5:0.5），加入适量无血清DMEM培养基，轻轻混匀。

（二）磷酸钙转染1.在上述质粒混合液中逐滴加入磷酸钙转染试剂溶液，边加边轻轻涡旋，室温放置1520分钟，使其形成磷酸钙质粒沉淀。2.将磷酸钙质粒沉淀逐滴加入到6孔板中的细胞培养孔内，轻轻晃动培养板，使沉淀均匀分布于细胞表面。3.将培养板置于37℃、5%CO₂培养箱中培养46小时。4.弃去细胞培养孔中的培养基，每孔加入2ml含100μM氯喹的DMEM培养基，继续培养46小时。5.弃去含氯喹的培养基，用PBS缓冲液洗涤细胞23次，然后加入2mlDMEM完全培养基，置于37℃、5%CO₂培养箱中继续培养。

（三）收集病毒上清1.转染后4872小时，观察细胞状态，当细胞出现明显病变时，收集细胞培养上清。2.将细胞培养上清转移至无菌离心管中，1000rpm离心5分钟，去除细胞碎片。3.将上清转移至新的无菌离心管中，0.45μm滤器过滤，去除细菌和支原体污染，得到粗制病毒上清液。

（四）病毒浓缩1.在粗制病毒上清液中加入PEG8000，使其终浓度达到8%，轻轻混匀，置于4℃冰箱过夜沉淀病毒。2.次日，4℃、12000rpm离心30分钟，弃上清。3.用适量PBS缓冲液重悬病毒沉淀，将病毒悬液转移至无菌离心管中。4.再次4℃、12000rpm离心30分钟，弃上清。5.用适量PBS缓冲液重悬病毒沉淀，得到浓缩后的病毒液，保存于80℃冰箱备用。

五、病毒滴度测定（一）实验原理采用荧光定量PCR法测定慢病毒滴度，通过检测病毒感染细胞后基因组中特定基因的拷贝数，结合感染细胞的数量，计算出病毒滴度。

（二）实验步骤1.细胞接种：将293T细胞接种于96孔板中，每孔接种密度为1×10⁴个细胞，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养过夜。2.病毒稀释：将浓缩后的病毒液进行梯度稀释，一般设置10⁻¹10⁻⁸等不同稀释度。3.病毒感染：每孔加入不同稀释度的病毒液100μl，同时设置未感染病毒的细胞作为阴性对照，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养48小时。4.细胞收获：48小时后，弃去细胞培养孔中的培养基，用PBS缓冲液洗涤细胞23次。5.DNA提取：按照DNA提取试剂盒的说明书提取细胞基因组DNA。6.荧光定量PCR：以提取的细胞基因组DNA为模板，采用针对慢病毒载体特定基因的引物和探针，进行荧光定量PCR反应。反应体系和条件按照荧光定量PCR试剂盒的说明书进行设置。7.结果分析：根据标准曲线计算出不同稀释度病毒感染细胞后基因组中特定基因的拷贝数，结合感染细胞的数量，通过公式计算病毒滴度。病毒滴度（TU/ml）=（C×V）/（N×D），其中C为荧光定量PCR检测到的病毒基因拷贝数，V为病毒感染细胞时加入的病毒液体积（ml），N为感染病毒的细胞数量，D为病毒稀释倍数。

六、注意事项1.实验操作过程应严格遵守无菌原则，防止细胞污染。2.各种试剂的配制应准确无误，特别是磷酸钙转染试剂溶液的配制，要注意试剂的纯度和pH值。3.转染时应注意磷酸钙质粒沉淀的形成和加入细胞的方式，避免沉淀不均匀或对细胞造成损伤。4.病毒包装过程中，细胞状态的观察至关重要，及时收集病毒上清，确保病毒