细胞培养的过程及注意事项

36细胞培养的过程及注意事项养而将细；一、原代培养；(一)过程；原代培养的基本过程包括取材、培养材料的制备、接种；1、组织块培养法；(1)基本操作过程；1)、用培养液湿润所取组织材料，并用锋利的眼科剪；2)、用湿润的吸管吸取切碎的组织块，清清吹到培养；3)、将培养瓶翻转，使瓶底朝上，在种植了组织块一；4)、将种植根据培养过程中与否需要分割培养物进行再培养一、原代培养(一)过程1)、用培养液湿润所取组织材料，并用锋利的眼科剪将附在其上的脂肪和结缔组织清除洁净。再用平衡液(PBS)或Hanks液漂洗；用锋利的眼科弯剪将组织块剪成小块；再用PBS或Hanks液漂洗多次，直至液体不浑浊、无油滴、清亮为止。2)、用湿润的吸管吸取切碎的组织块，清清吹到培养瓶皿中，并将其按一定间距均匀放在培养瓶底壁上，量不要过多，要将组织块切面贴在培养瓶底壁上；3)、将培养瓶翻转，使瓶底朝上，在种植了组织块一侧的对侧面加足培养液，勿使组织块与培养液接触，塞紧瓶塞；4)、将种植了组织块的一侧朝上，静置于37℃培养箱中；待组织块贴壁1h到3h后翻瓶，使贴壁的组织块浸没与培养液中，静置；5)、每隔2到3天更换一次培养液，或者根据培养瓶种颜色的变化确定换液时间。2、注意事项1)、组织块接种后的前3天，从组织块向外迁徙的细胞数很少，组织块的黏附不牢固，在观测和移动的过程中，注意不要引起液体的振荡。要防止常常翻动和振动，否则组织块不易附着于瓶壁上或附着后也会脱落飘起。2)、加入的培养液不适宜过多，防止浸泡的组织块受轻微的波动而脱落下3)、用组织块培养时，要及时观测，当细胞向外迁徙出来后要注意记录并清除漂浮的组织块和残留的细胞，由于已漂浮的组织块和那些细胞碎片已经死亡，它们产生的有毒物质会影响原代细胞的生长，要及时清除。4)、为增进组织块尽快粘贴在培养瓶皿上，可以在种植前先将胶原薄层涂在培养瓶底壁上。细胞培养过程中，胶原中的促细胞贴附因子先吸附于培养瓶底壁上，悬浮的圆形细胞再与已吸附有促贴物质的底壁附着。2、分离细胞培养法一贴壁型细胞培养(1)基本操作过程1)、首先用细胞分散法收获细胞，随时吸取少许消化液在镜下观测，并根据组织与否分散成细胞团或单个细胞，采用终止消化措施。用筛网滤掉未消化的组织块。2)、低速离心细胞悬液，弃掉上清液，加入含血清的培养液，轻轻吹打制成细胞悬液，计数并用培养液调整细胞密度。3)、根据培养的细胞类型和试验规定，用吸管吸取一定量的细胞悬液，加到培养瓶中。对于需要特殊底物的细胞，要先将底物涂一层于培养瓶皿底壁，然后接种细胞。4)、将培养瓶放入37℃恒温箱中培养。5)、每隔2到3天更换培养液一次或根据培养液颜色的变化确定换液时间。(2)注意事项1)原代培养的分离细胞在初次接触体外环境时，虽然被分散成单个细胞，但它们之间的互相影响还是存在的，并且这种影响对细胞能否存活是非常重要的。在这些细胞之间能产生某些促生长的活性物质，使细胞彼此互相增进存活和生长。假如接种的细胞密度过低，细胞之间的促生长作用很小，虽然营养物质很充足，也很难使细胞适应从体内的组织环境到被分散后进入独立生存环境的变化过程。假如接种的细胞密度过大，会导致营养物质供应局限性，代谢废物积累较快需要常常换液和传代。2)原代培养时初始培养在组织分散和分离细胞时细胞也许会受到严重的损伤。合适增大原代培养接种的细胞密度，给培养的细胞提供更多的类似于在体内时细胞之间的互相作用，会极大提高原代培养的细胞在体外存活率。待细胞适应体外环境后进行传代培养时再以较低的密度接种和培养。3)由于细胞之间的互相的内在联络被打破，分离细胞在体外培养时经历的生存环境变化很大，在体外存活和生长的难度对应增长。对于贴壁依赖性细胞来说，尽快使接种的细胞贴壁，是决定培养能否成功的关键。可以在接种后先将培养瓶置培养箱内培养3h到5h,由于细胞悬液中带有少许培养液，细胞即可以维持存活，又可以很快接触到培养瓶底壁，是细胞迅速黏附于底物，待细胞贴壁后，再补足培养液继续培养。3、分离细胞培养法—悬浮型细胞培养(1)操作过程1)制备细胞悬浊液，计数并用培养液调整细胞密度。2)在培养皿中加入足够的培养液。3)将欲接种的细胞接种到培养器皿中。4)在培养皿内放入一种有聚四氟乙烯包被的磁棒。将培养皿封口，送入恒5)培养液略呈黄色换液。吸出部分旧培养液，加入新鲜培养液即可。(2)注意事项1)进行悬浮细胞培养时必须保持细胞的悬浮状态。可以通过增长培养液的2)可以进行悬浮培养的细胞，其生命力一般都比较旺盛，体外分裂增殖的(二)原代培养的注意事项2、伴随培养的进程，培养液中的营养物质被逐渐酸、丙酮酸等也逐渐增长。伴随酸性物质的增长，培养液中的pH值越来越低，换液时，应将培养液事先预温至37℃。一般培养一天，组织细胞即可在培养瓶皿底壁黏附并贴壁生长。2天到3天二、传代培养1、组织块培养物的传代过程(1)将原代培养物连同底物盖玻片一同取出，置于无菌的培养皿上。(2)用刀将培养物分割，刮去多出的部分，剩余继续培养的部分。一般是分割刮去组织块外围的部分组织，留下中央的部分组织继续培养。或部分分割并挑去组织块，留下迁移出来的细胞于底物盖玻片上继续培养。也可以将组织块挑出，再种植于新的底物盖玻片上继续培养。(3)给剩余的培养物加上培养液，放入培养箱中继续培养。2、分离细胞培养物一贴壁型细胞的传代过程：有两项关键工作：一是分割培养物，二是再接种。(1)取出培养瓶，打开瓶盖，用吸管吸出旧的培养液。(2)用无Ca、Mg的平衡盐溶液轻轻漂洗培养物1次到2次，洗去残存血清后弃去平衡盐溶液。(3)在培养皿内加入胰蛋白酶溶液，室温下消化5min到15min显微镜下观测细胞突起缩回近似圆形、细胞之间的间隙增大时停止消化。(4)吸管吸去消化液后立即加入含血清培养液或蛋白酶克制剂，克制胰蛋白酶的活性，使消化终止。(5)用弯头吸管吸取培养皿内的培养液反复吹打瓶皿底壁，使已经消化的细胞脱离瓶皿底壁。(6)低速离心，弃去上清液。(7)用新鲜培养液将细胞沉淀重新悬浮，计数并调整细胞密度。2+2+(8)根据传代目的将细胞悬浮液接种到一种或多种新的培养器皿中。3、分离细胞培养物—悬浮型细胞的传代过程(1)将培养物移入离心管低速离心。根据传代目的将细胞悬液接种在一种或多种新的培养皿中。(2)用吸管吸去上清液，加入新鲜培养液使细胞沉淀重新悬浮(3)根据传代目的将细胞悬液接种在一种或多种新的培养皿中。(4)加足培养液，加盖封口，加入恒温箱中继续培养。(二)传代培养的注意事项1、离体培养的细胞生命力比较脆弱，因此传代时细胞没有